怎样设计引物克隆已经构建好的t载体基因来构建表达载体？

一、怎样设计引物克隆已经构建好的t载体基因来构建表达载体？

如果t载体上没有表达载体上需要的酶切位点，就要重新设计带酶切位点的引物，PCR扩增t载体后酶切并连表达载体。

如果t载体上有需要的酶切位点，直接酶切后回收目的片段，连接表达载体即可。

二、t载体通用引物是啥？

以t载体为培养基,双酶消化t载体,凝胶运行检测能清晰地看到酶消化产物,并有特异性回收。

通用引物：一般是指某基因外围保守序列.虽然这个基因可能是序列多变的,（如同功酶）,但两侧翼序列则是保守的.利用俩侧翼保守序列设计出来的引物,称为通用引物.

有M13、T7、T3、Sp6

三、构建表达载体下游引物需要加终止密码子吗？

得看用什么载体。如果后面没有标签蛋白，就要加终止密码子，否则就不需要加。

四、如何设计引物？

1、首先要拿到自己要设计引物的目的基因。这里我使用一段GFP基因给大家讲解。将目的基因保存在txt文档里面，或者直接复制下来后在DNAMAN里面新建文档复制进去。下面是我们要设计引物的GFP基因序列。

2、打开DNAMAN，选择菜单里面的Primer-->Load Primer-->From Input。将上一步中的目的基因序列从开头开始的20个左右的碱基复制粘贴进去(引物长度要在15—30bp之间，常用的是18-27bp)，比如我们先试试前20个碱基是否合适，将ATTGATGTGATATCTCCACT这20个碱基复制粘贴进去，点击OK。

3、再次点击Primer，选择Melting Temperature，打开对话框。这里面可以看到你的碱基序列，个数以及Thermo，也即Tm值，是溶解温度。Tm值一般在55℃到70℃之间比较好，PCR仪的退火温度一般设定比primer的Tm低5℃（不过一般情况我们都设定为55℃，因此Tm值在60左右比较好）。

4、从上图可以看到我们这20个碱基的Tm值只有49度，显然太低，需要增加碱基数量。我们取前24个碱基粘贴进去，点击下方Show Tm便可以看到这个引物的Tm值，发现是60.3度，很合适，就用这个了。这样正向引物就设计完了，把这24个碱基序列保存下来。

5、设计反向引物需要将目的基因序列进行反向互补，然后按照正向引物一样的方法设计便可。反向互补操作可以在DNAMAN里面快速方便进行。打开DNAMAN，选择左侧第一个Channel，然后点击菜单栏的Sequence-->Load Sequence-->From Sequence File…将我们保存目的基因的txt文档导入到软件中。【打开txt文档的时候记得在打开窗口中的文件类型里面选择All Files】

6、可以看到序列被导入到了第一个Channel，双击这个Channel便可以看到我们的序列的详细信息。

7、保持Channel 1选中的状态，选择Sequence-->Display Sequence，打开对话框。

8、选择对话框中的Reverse Complement Seq，其他的复选框都取消。然后点击OK。

9、这样就可以看到目的基因的反向互补序列了。

10、对这个反向互补序列进行和上面设计正向序列引物一样的操作，设计引物便可。具体的不再啰嗦，我直接把我的设计结果告诉大家：选择前24个碱基，也即TCAAAGATCTACCATGTACAGCTC，Tm值为57.6，比较合适。到此引物设计就结束了。拿着刚才设计的正向引物和这里设计的反向引物就可以找公司帮我们合成引物了。

五、如何用dnaman软件设计引物及找到引物上的酶切位点？

在创口上部菜单栏中找到有search功能的按键，会弹出一个小文本框窗口，输入你的引物序列，然后让它寻找(search)。但是要注意引物有正义链与反义链输入的区别。 不知道你的引物是普通的25个碱基，还是30个碱基以上的超长引物。后者引物可以用alignment(比对)试试。不过也要注意正义、反义链的输入。

六、lamp引物设计原则？

1.

引物自身及引物之间不应存在互补序列.连续互补的碱基应该要少于4 个.引物应使其△G 值不要太高,△G 值越大,则双链越稳定.

2.

引物长度和GC 含量要适中.引物长度大概为18~28 bp,但不应大于38 bp,引物过短会影响到扩增的特异性,太长的话其延伸温度将会大于74 ℃,不利Taq 酶的催化反应.若扩增产物为4~5 kb,引物最好不要少于24bp;如果目的产物≤500 bp,引物长度只要16~18 bp 即可.上下游引物间的Tm 值的差值最好在10 ℃以内,GC 含量最好是40%~60%.

3.

3′端不应该存在相似性高的序列,否则容易导致错配.3′端不能有多于3 个连续的G 或C,要不然引物错配

七、primer如何设计引物？

首先,选取目的基因序列,对格式没有什么要求,只需要将目的基因序列复制就可以。

2.打开File目录下的New,选择Sequence。这里的另一个Project选项...

3.打开Sequence后,会弹出粘贴框,只需要将刚刚复制的基因序列粘贴上即可,...

4.选择上方的红蓝双向箭头的按钮进行引物设计,在设计开始前可以更改设计的参数,...

八、为什么设计引物？

DNA聚合酶在PCR扩增过程中只能将新的脱氧核苷酸添加到已存在的3’端,与新的核苷酸的磷酸基团形成新的磷酸二酯键。引物的作用就是,在PCR退火过程中结合到正义链上，从而提供3’端羟基。

九、低表达载体与表达载体什么区别？

低表达载体表示水平比较低，表达载体就是标准型的。

十、载体和表达载体的区别？

1、性质不同 表达载体：生物学中，基因工程的基本操作，表达载体(Expression vectors)就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。 克隆载体：克隆载体通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的 外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。

2、组成不同 表达载体：表达载体四部分：目的基因、启动子、终止子、标记基因。 克隆载体：常见的载体有质粒、噬菌粒、酵母人工染色体。

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