1. 甲基化分析网站
1、种类：染色质的共价修饰主要是组蛋白的修饰。
2、组成核小体的组蛋白八聚体的组蛋白H3和H4是蛋白酶修饰的主要位点。
3、意义：M i22NHRD 由核心(HDAC1、HDAC2、RBA P46öRBA P48) + M i2、M TA 1öM TA 2、MBD3 组成, 其中MBD3 含有MBD 样序列, 与甲基化DNA有低亲和力, 分析发现MBD3 与甲基化有关的氨基酸被置换, 由此推测MBD3 与MBD2 相互作用而使M i22NURD 与甲基化DNA 结合。由此看出, DNA 甲基化和组蛋白去乙酰化协同作用共同参与转录阻遏。此外,M i22NURD 还有染色质重塑活性, 所以S IN 3 和M i22 NURD 可能分别在长期和短期转录阻遏调节中起作用。
2. 甲基化测定
1. 生物检测法
利用植物激素作用于植物组织或离体器官后产生的特异性反应，从而间接对植物激素的含量进行检测。然而，不同结构的赤霉素、生长素或激动素对不同生物检测法的响应有差异，因此有时可能无法测出。由于生物检测法可以检测植物激素的活性，常用于植物激素的定性分析，也常与其他检测方法结合使用。
2. 气相色谱法
通过与标准样品共色层分离来鉴定样品中植物激素的含量，但由于无法排除杂质与标准品的共色层分离，所以不能准确检测植物激素含量。待测样品必须形成易挥发的甲基化和三甲基硅烷化衍生物才可以运用气相色谱法检测，所以在乙烯的测定种，气相色谱法比较常用。
3. 酶联免疫法（ELISA法）
将抗原或抗体与酶结合形成酶标抗原或抗体，加入酶反应的底物后，底物被酶催化生成有色产物，通过颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。酶联免疫吸附法的主要缺点在于抗体的制备复杂，且检测中难以排除交叉反应，无法保证植物激素检测的准确性。
4. 高效液相色谱法
高效液相色谱法与不同检测器结合，能直接分析多种植物激素，是目前应用较广泛的植物激素检测方法之一。除乙烯外的其它植物激素均可以采用高效液相色谱法进行检测。
5. 质谱法
液质联用（LC-MS）和气质联用（GC-MS）克服了高效液相色谱和气相色谱的在植物激素定性和定量方面的局限性，成为普遍接受和认可的植物激素检测方法。GC-MS具有选择性好、专一性强、灵敏度高等特点，不足之处在于对样品的纯化要求很高，且样品需要衍生化处理。不同于GC-MS，LC-MS不需要衍生化处理，简化了操作步骤，缩短了检测时间。因此LC-MS更适用于植物激素的检测（除乙烯外）。
3. 甲基化预测网站
DNA甲基化的生物学作用DNA甲基化与遗传印记、胚胎发育DNA甲基化在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育过程中起着极其重要的作用。
研究表明胚胎的正常发育得益于基因组DNA适当的甲基化。例如：缺少任何一种甲基转移酶对小鼠胚胎的发育都是致死性的。
此外，等位基因的抑制(allelic repression)被印记控制区(imprinting control regions, ICRs)所调控,该区域在双亲中的一个等位基因是甲基化的。
印记基因的异常表达可以引发伴有突变和表型缺陷的多种人类疾病。2 DNA甲基化与肿瘤 甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要因素,这种变化包括基因组整体甲基化水平降低和CpG岛局部甲基化水平的异常升高,从而导致基因组的不稳定(如染色体的不稳定、可移动遗传因子的激活、原癌基因的表达)和抑癌基因的不表达。
如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，则发生癌症的机率提高,例如：胰岛素样生长因子-2（IGF-2）基因印记丢失导致多种肿瘤,如。
目前肿瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因。
这是因为人们发现肿瘤的发生可能与抑癌基因启动子区的CpG岛甲基化造成抑癌基因关闭有关。
由于CpG岛的局部高度甲基化早于细胞的恶性增生，因此甲基化的诊断可以用于肿瘤发生的早期预测，而且全基因组的低甲基化也随着肿瘤发生而出现，并且其随着肿瘤恶性度的增加而显著，因此甲基化的检测可用于肿瘤的分级。
4. 甲基化分析是什么
甲醇：分子式：CH4O，结构简式：CH3OH，
乙醇：分子式：C2H6O，结构简式：C2H5OH。
甲醇
甲醇（Methanol）又称羟基甲烷，是一种有机化合物，有毒。是结构最为简单的饱和一元醇。其化学式为CH3OH/CH4O，其中CH3OH是结构简式，能突出甲醇的羟基，CAS号为67-56-1，分子量为32.04，沸点为64.7℃。因在干馏木材中首次发现，故又称“木醇”或“木精”。人口服中毒最低剂量约为100mg/kg体重，经口摄入0.3～1g/kg可致死。用于制造甲醛和农药等，并用作有机物的萃取剂和酒精的变性剂等。成品通常由一氧化碳与氢气反应制得。
中文名
甲醇
外文名
methanol
别名
羟基甲烷、木醇、木精
化学式
结构简式CH3OH；分子式CH4O
分子量
32.04
制备方法应用领域安全措施
理化性质
物理性质
1.性状：无色透明液体，有刺激性气味。
2.熔点（℃）：-97.8
3.沸点（℃）：64.7
4.相对密度（水=1）：0.79
5.相对蒸气密度（空气=1）：1.1
6.饱和蒸气压（kPa）：12.3（20℃）
7.燃烧热（kJ/mol）：723
8.临界温度（℃）：240
9.临界压力（MPa）：7.95
10.辛醇/水分配系数：-0.82~-0.77
11.闪点（℃）：8（CC）；12.2（OC）
12.自燃温度（℃）：436
13.爆炸上限（%）：36.5
14.爆炸下限（%）：6
15.溶解性：与水互溶，可混溶于醇类、乙醚等多数有机溶剂。
16.折射率（N/D，20℃）：1.3284
17.黏度（mPa·s，25℃）：0.5525
18.蒸发热（KJ/mol，b.p.）：35.32
19.熔化热（KJ/kg）：98.81
20.比热容：KJ/（kg·K），20℃，定压：2.51
21.沸点上升常数：0.785
22.电导率（S/m，25℃）：1.5×10-9
23.热导率（W/（m·K），30℃）：21.3527
24.体膨胀系数（K，20℃）：0.00119
25.临界密度（g/cm）：0.273
26.临界体积（cm/mol）：117
27.临界压缩因子：0.223
28.偏心因子：0.566
29.Lennard-Jones参数：3.8632（A）；419.86（K）
30.溶度参数（J/cm）：29.532
31.van der Waals体积（cm/mol）：21.710
32.气相标准燃烧热（焓）（kJ/mol）：764.9
33.气相标准生成热（焓）（ kJ/mol） ：-201.5
34.气相标准熵（J·mol-1/K） ：239.88
35.气相标准生成自由能（ kJ/mol）：-161.6
36.气相标准热熔（J·mol-1/K）：44.06
37.液相标准燃烧热（焓）（kJ/mol）：-726.9
38.液相标准生成热（焓）（ kJ/mol）：-239.1
39.液相标准熵（J·mol-1/K） ：127.24
40.液相标准生成自由能（ kJ/mol）：-166.88
41.液相标准热熔（J·mol-1/K）：81.4[1]
化学性质
甲醇由甲基和羟基组成的，具有醇所具有的化学性质。
甲醇可以与氟气、氧气等气体发生反应，在纯氧中剧烈燃烧，生成水蒸气和二氧化碳
2CH3OH+3O2=2CO2+4H2O
而且，甲醇还可以发生氨化反应（370℃～420℃）
NH3+CH3OH→CH3NH2+H2O
NH3+2CH3OH→(CH3)2NH+2H2O
NH3+3CH3OH→(CH3)3N+3H2O
甲醇也可在空气中燃烧：2CH4O＋3O2＝燃烧＝2CO2＋4H2O
甲醇具有饱和一元醇的通性，由于只有一个碳原子，因此有其特有的反应。例如
① 与氯化钙形成结晶状物质CaCl2·4CH3OH，与氧化钡形成BaO·2CH3OH的分子化合物并溶解于甲醇中；类似的化合物有MgCl2·6CH3OH、CuSO4·2CH3OH、CH3OK·CH3OH、AlCl3·4CH3OH、AlCl3·6CH3OH、AlCl3·10CH3OH等
4CH3OH+CaCl2→CaCl2·4CH3OH
2CH3OH+BaO→2CH3OH·BaO
② 与其他醇不同，由于-CH2OH基与氢结合，氧化时生成的甲酸进一步氧化为CO2
2CH3OH+O2→2HCHO+2H2O
2HCHO+O2→2HCOOH
2HCOOH+O2→2H2O+2CO2
③ 甲醇与氯、溴不易发生反应，但易与其水溶液作用，最初生成二氯甲醚(CH2Cl)2O，因水的作用转变成HCHO与HCl
2CH3OH+2Cl2=(CH2Cl)2O+H2O+2HCl
(CH2Cl)2O+H2O=2HCHO+2HCl
④ 与碱、石灰一起加热，产生氢气并生成甲酸钠
CH3OH+NaOH→HCOONa+2H2
⑤ 与锌粉一起蒸馏，发生分解，生成CO和H2O[2]
计算化学数据
1.疏水参数计算参考值（XlogP）：-0.5
2.氢键供体数量：1
3.氢键受体数量：1
4.互变异构体数量：无
5.拓扑分子极性表面积20.2
6.重原子数量：2
7.复杂度：2
8.共价键单元数量：1[1]
制备方法
合成法
1.甲醇的生产，主要是合成法，合成的化学反应式为：
2H2+CO→CH3OH[3]
2.将合成后的粗甲醇，经预精馏脱除甲醚。（高压法最先实现工业合成的方法，但因其能耗大，加工复杂，材质要求苛刻，产品中副产物多，由ICI低压和中压法及Lurgi低压和中压法取代。工业上合成甲醇几乎全部采用一氧化碳加压催化加氢的方法，工艺过程包括造气、合成净化、甲醇合成和粗甲醇精馏等工序。）
3.将粗甲醇净化，净化过程包括精馏和化学处理。化学处理主要用碱破坏在精馏过程中难以分离的杂质，并调节pH值；精馏主要是脱除易挥发组分如二甲醚，以及难挥发的乙醇、高碳醇和水。粗馏后的纯度一般都可达到98%以上。
4.将工业甲醇用精馏的方法将含水量降到0.01%以下。再用次碘酸钠处理，可除去其中的丙酮。经精馏得纯品甲醇。
5.BV-Ⅲ级甲醇的制备主要采用精馏工艺。以工业甲醇为原料，经精馏、超净过滤、超净分装，得高纯甲醇产品。一般均以工业甲醇为原料，经常压蒸馏除去水分，控制塔顶64～65℃，过滤除去不溶物即可。[1]
干馏法
最早是用木材干馏法生产甲醇，故甲醇也叫木醇。其中自然游离状态的甲醇非常的少，故这种方法既浪费木材，产品又含有丙酮等杂质，并且很难除去。因为这种方法不能满足需要，1924年以后，人们开始逐渐停止使用这个方法。[4]
应用领域
1、基本有机原料之一，用于制造氯甲烷、甲胺和硫酸二甲酯等多种有机产品。也是农药（杀虫剂、杀螨剂）、医药（磺胺类、合霉素等）的原料，合成对苯二甲酸二甲酯、甲基丙烯酸甲酯和丙烯酸甲酯的原料之一。[5]
2、甲醇的主要应用领域是生产甲醛，甲醛可用来生产胶粘剂，主要用于木材加工业，其次是用作模塑料、涂料、纺织物及纸张等的处理剂。
3、甲醇另一主要用途是生产醋酸。醋酸消费约占全球甲醇需求的7%，可生产醋酸乙烯、醋酸纤维和醋酸酯等，其需求与涂料、粘合剂和纺织等方面的需求密切相关。
4、甲醇可用于制造甲酸甲酯，甲酸甲酯可用于生产甲酸、甲酰胺和其他精细化工产品，还可用作杀虫剂、杀菌剂、熏蒸剂、烟草处理剂和汽油添加剂。
5、甲醇也可制造甲胺，甲胺是一种重要的脂肪胺，以液氮和甲醇为原料，可通过加工分立为一甲胺、二甲胺、三甲胺，是基本的化工原料之一。
6、可合成为碳酸二甲酯，是一种环保产品，应用于医药、农业和特种行业等。
7、可合成为乙二醇，是石化中间原料之一，可用于生产聚酯和防冻剂。
8、可用于制造生长促进剂。可以使作物大量增产，保持枝叶鲜嫩、茁壮茂盛、在夏天也不会枯萎，可大量减少灌溉用水，有利于旱地作物的生长。
9、可合成甲醇蛋白，以甲醇为原料经微生物发酵生产的甲醇蛋白被称为第二代单细胞蛋白，与天然蛋白相比，营养价值更高，粗蛋白含量比鱼粉和大豆高得多，而且含有丰富的氨基酸、矿物质和维生素，可以代替鱼粉、大豆、骨粉、肉类和脱脂奶粉。[6]
10、甲醇用作清洗去油剂，MOS级主要用于分立器件，中、大规模集成电路，BV-Ⅲ级主要用于超大规模集成电路工艺技术。
11、用作分析试剂，如作溶剂、甲基化试剂、色谱分析试剂。还用于有机合成。
12、通常甲醇是一种比乙醇更好的溶剂，可以溶解许多无机盐。亦可掺入汽油作替代燃料使用。20世纪80年代以来，甲醇用于生产汽油辛烷值添加剂甲基叔丁基醚、甲醇汽油、甲醇燃料，以及甲醇蛋白等产品，促进了甲醇生产的发展和市场需要。
13、甲醇不仅是重要的化工原料，而且还是性能优良的能源和车用燃料。甲醇与异丁烯反应得到MTBE（甲基叔丁基醚），它是高辛烷值无铅汽油添加剂，亦可用作溶剂。除此之外，还可制烯烃和丙烯，解决资源短缺问题。
14、甲醇可用于生产二甲醚，二甲醚除了在日用化工、制药、农药、染料、涂料等方面有广泛的用途，还具有方便清洁、十六烷值高、动力性能好、污染少。易加压为液体、易储存等燃料性能。甲醇和二甲醚按一定比例配制而成的新型液体燃料称为醇醚燃料。它的燃烧效率和热效率均高于液化气。[7]
安全措施
健康危害
甲醇被大众所熟知，具有毒性。工业酒精中大约含有4%的甲醇，若被不法分子当作食用酒精制作假酒，饮用后，会产生甲醇中毒。甲醇的致命剂量大约是70ml。
甲醇的毒性对人体的神经系统和血液系统影响最大，它经消化道、呼吸道或皮肤摄入都会产生毒性反应，甲醇蒸气能损害人的呼吸道粘膜和视力。在甲醇生产工厂，中国有关部门规定，空气甲醇的浓度限制为PC-stel=50mg/m3，PC-TWA=25mg/m3，在有甲醇气的现场工作须戴防毒面具、工厂废水要处理后才能排放，允许含量小于200mg/L的甲醇。
甲醇的中毒机理是，甲醇经人体代谢产生甲醛和甲酸（俗称蚁酸），然后对人体产生伤害。常见的症状是，先是产生喝醉的感觉，数小时后头痛，恶心，呕吐，以及视线模糊。严重者会失明，乃至丧命。失明的原因：甲醇的代谢产物甲酸累积在眼睛部位，破坏视觉神经细胞。脑神经也会受到破坏，而产生永久性损害。甲酸进入血液后，会使组织酸性越来越强，损害肾脏导致肾衰竭。[8]
毒性：属低毒毒性。
急性毒性：LD50：5628mg/kg（大鼠经口），15800mg/kg（兔经皮）；LC50：82776mg/kg，4小时（大鼠吸入）；人经口5～10ml，潜伏期8～36小时，致昏迷；人经口15ml，48小时内产生视网膜炎，失明；人经口30～100ml中枢神经系统严重损害，呼吸衰弱，死亡。
亚急性和慢性毒性：大鼠吸入50mg/m3，12小时/天，3个月，在8～10周内可见到气管、支气管粘膜损害，大脑皮质细胞营养障碍等。
致突变性：微生物致突变：啤酒酵母菌12pph。DNA抑制：人类淋巴细胞300mmol/L。
生殖毒性：大鼠经口最低中毒浓度（TDL0）：7500mg/kg（孕7～19天），对新生鼠行为有影响。大鼠吸入最低中毒浓度（TCL0）：20000ppm（7小时，孕1～22天），引起肌肉骨骼、心血管系统和泌尿系统发育异常。
接触限制
甲醇对人体有低毒，因为甲醇在人体新陈代谢中会氧化成比甲醇毒性更强的甲醛和甲酸（蚁酸）。
初期中毒症状包括心跳加速、腹痛、上吐（呕）、下泻、无胃口、头痛、晕、全身无力。严重者会神智不清、呼吸急速至衰竭。失明是最典型的症状，甲醇进入血液后，会使组织酸性变强产生酸中毒，导致肾衰竭。最严重者是死亡。
然而，仍然有不少不法商人不顾生命安全，用含有甲醇的工业酒精勾兑假酒并出售。但是，正品酒中也有极微量的甲醇，是宿醉的原因之一。甲醇中毒可以用乙醇解毒。因为甲醇在肝脏中被酒精脱氢酶氧化成甲醛，然后形成甲酸。乙醇可以和甲醇竞争醇脱氢酶，而使人体有时间排除甲醇。
危害防治
中毒症状
身体危害：对中枢神经系统有麻醉作用；对视神经和视网膜有特殊选择作用，引起病变；可致代谢性酸中毒。
急性中毒：短时大量吸入出现轻度眼上呼吸道刺激症状（口服有胃肠道刺激症状）；经一段时间潜伏期后出现头痛、头晕、乏力、眩晕、酒醉感、意识朦胧、谵妄，甚至昏迷。视神经及视网膜病变，可有视物模糊、复视等，重者失明。代谢性酸中毒时出现二氧化碳结合力下降、呼吸加速等。
慢性影响：神经衰弱综合征，植物神经功能失调，粘膜刺激，视力减退等。皮肤出现脱脂、皮炎等。
急救措施
皮肤接触：脱去污染的衣着，用肥皂水和清水彻底冲洗皮肤。
眼睛接触：提起眼睑，用流动清水或生理盐水冲洗，就医。
吸入：迅速脱离现场至空气新鲜处。保持呼吸道通畅。如呼吸困难，给输氧。如呼吸停止，立即进行人工呼吸，就医。
食入：饮足量温水，催吐或用清水或 1%硫代硫酸钠溶液洗胃，就医。
甲醇中毒，通常可以用乙醇解毒法。其原理是，甲醇本身无毒，而代谢产物有毒，因此可以通过抑制代谢的方法来解毒。甲醇和乙醇在人体的代谢都是同一种酶，而这种酶和乙醇更具亲和力。因此，甲醇中毒者，可以通过饮用烈性酒（酒精度通常在60度以上）的方式来缓解甲醇代谢，进而使之排出体外。而甲醇已经代谢产生的甲酸，可以通过服用小苏打（碳酸氢钠）的方式来中和。[9]
泄漏应急处理
迅速撤离泄漏污染区人员至安全区，并进行隔离，严格限制出入，切断火源。建议应急处理人员戴自给正压式呼吸器，穿防静电工作服，不要直接接触泄漏物，尽可能切断泄漏源。防止流入下水道、排洪沟等限制性空间。小量泄漏：用砂土或其它不燃材料吸附或吸收，也可以用大量水冲洗，洗水稀释后放入废水系统。大量泄漏：构筑围堤或挖坑收容，用泡沫覆盖，降低蒸气灾害。用防爆泵转移至槽车或专用收集器内，回收或运至废物处理场所处置。[9]
紧急情况概述
液体。高度易燃，其蒸气与空气混合，能形成爆炸性混合物。吞食后有毒。跟皮肤接触有毒。吸入有毒。短期暴露有严重损伤健康的危险。
GHS危险性类别
根据GB 30000-2013化学品分类和标签规范系列标准（参阅第十五部分），该产品分类如下：易燃液体 ，类别 2；急毒性-口服 ，类别 3；急毒性-皮肤 ，类别 3；急毒性-吸入 ，类别 3；特定目标器官毒性-单次接触 ，类别 1。
安全标志
危险运输编码：UN 1230 3/PG 2
危险品标志： 易燃有毒
安全标识：S7/S16/S24/S45/S36/S37/S39
危险标识：R11/R23/R24/R25/R39
储存运输
储存注意事项
储存于阴凉、通风良好的专用库房内，远离火种、热源。库温不宜超过37℃，保持容器密封。应与氧化剂、酸类、碱金属等分开存放，切忌混储。采用防爆型照明、通风设施。禁止使用易产生火花的机械设备和工具。储区应备有泄漏应急处理设备和合适的收容材料。
运输注意事项
本品铁路运输时限使用钢制企业自备罐车装运，装运前需报有关部门批准。运输时运输车辆应配备相应品种和数量的消防器材及泄漏应急处理设备。夏季最好早晚运输。运输时所用的槽（罐）车应有接地链，槽内可设孔隔板以减少震荡产生静电。严禁与氧化剂、酸类、碱金属、食用化学品等混装混运。运输途中应防曝晒、雨淋，防高温。中途停留时应远离火种、热源、高温区。装运该物品的车辆排气管必须配备阻火装置，禁止使用易产生火花的机械设备和工具装卸。公路运输时要按规定路线行驶，勿在居民区和人口稠密区停留。铁路运输时要禁止溜放。严禁用木船、水泥船散装运输。
消防要点
主要有：抗溶性泡沫、干粉、二氧化碳、砂土等。灭火方法：尽可能将容器从火场移至空旷处。喷水保持火场容器冷却，直至灭火结束。处在火场中的容器若已变色或从安全泄压装置中产生声音，必须马上撤离。
5. 甲基化分析软件
相信在这个世界上，没人不惧怕衰老。由此也衍生出出了极具价值的“抗老经济”，女性的医美、护肤、化妆品，男性的食补、撸铁、马拉松。尤其在脸，这个衰老最明显的部位上，人们甚至会做出一些非常丧心病狂的事：欧洲女伯爵用处女血洗澡，埃及皇后做鳄鱼粪面膜，清宫妃子用口水涂脸……
之所以人们会尝试种种玄学方法，是因为皮肤变化这件事是很难量化的。除了一些立竿见影的医美方法，大多数护肤手段都需要更长时间才能体现出功效，其中又掺杂了大量变量和一些心理安慰剂作用，让人很难真正确认护肤产品的功能。
不过最近AI测肤的流行正在改变这种现状。
通过眼角照片精确识别肤龄，但这一切并不新鲜
最近在衰老领域研究期刊《Aging》上发表了一篇论文，说明了一种利用深度学习的非入侵式皮肤生理年龄监测方式，为皮肤衰老这件事打开了一种新的思路。
我们知道，就像心理年龄和生理年龄一样，皮肤的“肤龄”更能表现出我们身体的状态。有时候一位四五十岁的中年人也可以拥有年轻的皮肤，而年轻人却可能会拥有高肤龄。而肤龄则可以很好的推断出身体机能的衰老状态，而不是仅仅依靠身份证上的年龄。
这种能够测试出“肤龄”的算法名为“PhotoAgeClock”，建立在通过人脸识别识别年龄的技术上，研究者将人脸的部分继续细化，最终发现可以通过眼角照片进行图像识别，通过皮肤状况来判断身体的衰老程度。
在测试中发现，这种通过图像识别进行判断的方式，准确度甚至比通过抽血进行甲基化测试还要高。
而参与这项研究的，是一家名为Haut．AI的爱沙尼亚企业，这家企业主打的就是建立在AI测肤参数追踪上的皮肤病变和个性化护肤业务。
也就是说，建立在图像识别这种轻量级量化衰老以及皮肤状况的技术上，AI测肤可以有很多想象空间。
首先对于皮肤衰老状况量化表示，可以让护肤抗老这件事更加个性化。消费者可以根据自己皮肤的详细状况选择对应的产品。
同时在研发阶段，AI测肤也可以更精细的追踪产品的作用能力，让护肤品研发者可以随时发现皮肤的变化情况，提高研发效率等。
等等，这些话术怎么听起来这么耳熟？
从专业科研到娱乐卖货，AI测肤的冰火两极
其实对于中国消费者来说，AI测肤早就不是什么新鲜事了。
在去年，美图美妆就推出了AI测肤功能，在一些商场中，我们还能看到和电话亭一样的“智能测肤机”，在今年，华为和荣耀也在新款手机上推出了“爱肌肤”功能。在一些护肤品牌的天猫旗舰店中，用户也能找到通过拍照一键测肤的功能……
这些AI测肤产品基本大同小异：通过后置摄像头对面部进行拍摄，识别出脸部的哪些部位有痘痘、出油、黑头和细纹。这种一下数清楚你有多少颗黑头的技术看似很厉害，实际上只要稍微一动脑子就会发现并没有什么卵用。
因为和PhotoAgeClock这种通过拍照实现和血液检测一样精准的年龄检测不同，这些普通的AI测肤所提供的信息，并没有超过人自己的认知范围——我有没有痘痘黑头，自己照照镜子不就知道了，还用你说？
更何况，这些测肤产品到最后无一不是引流到电商，告诉你应该购买什么护肤品，一天敷几片面膜。
如果我们简单地区分一下“有用的” AI测肤和“没用的”AI测肤，可以看到两者之间有着很明显的区别：
1、 有用的AI测肤出自AI企业和护肤品企业，没用的AI测肤出自卖货企业
其实所谓AI测肤并不是最近几年AI热时才出现的概念。宝洁公司从20年前就开始收集不同光照条件下的人脸数据，并从中获取肤质信息。比起护肤品企业的专业程度，和AI企业的强大技术，以美图美妆为代表的“电商导流”AI测肤在技术上并不完善。很多使用者也评价说，这些AI测肤用起来并不精准、在不同光照条件下结果相差很多，参考价值并不高。
同样，这些为了卖货的AI测肤也没能像Haut．AI这类专业AI企业一样，通过学术论文证明的自己的观点。可以说是在护肤和AI两方面都成绩堪忧。
2、有用的AI测肤重新量化信息，没用的AI测肤告诉你你已经知道的东西
就像去专柜一样，BA如果只告诉你脸上有黑头和出油，你会觉得对方在为了推销说废话。但如果BA把你皮肤状况细分到“真皮层”、“胶原蛋白纤维”、“基底膜”等等一般人不了解的地方，就更容易让人信服。同样，有价值的AI测肤应当是利用简单的方法，让更多人得知类似皮肤衰老情况、紫外线照射这样平时很难获知的信息。
除了能测皮肤衰老状况的PhotoAgeClock以外，露得清母公司和创业企业FitSkin合作的皮肤扫描仪也是一样，通过特殊传感器获取皮肤含水量；包括欧莱雅最近UV指甲贴，则用来获知紫外线这种平时我们很难精准量化的东西。
3、有用的AI测肤服务于B端，没用AI测肤只会为商品导流
同样的道理，其实在护肤这件事上，消费者和研发者之间是存在巨大的认知差异的。有的人可能有过去化妆品专柜测肤质的经历，最终得出来的一系列数据，需要BA讲解才能明白。同样，掌握着AI技术的科技企业和消费者自己是很难通过皮肤状态上数值变化来和护肤产品、手法等等对应起来的，是典型的“有题目，没解法”。如果仅仅导向商品，很难让人不觉得这又是一笔智商税。
其实真正受益于AI测肤并不是消费者，而是护肤产品的研发者。像Haut．AI所提供的就是云端SaaS服务，研发者收集好自己消费者的数据，在SaaS平台中得出计算结果，进而去促进研发。
AI测肤未来：和所有AI一样去到需要效率的地方
而AI测肤目前面对的最大问题，就是娱乐化风潮和认知失调下带来的收益不均等。
从娱乐化来讲，通过现在这些随处可见“AI测肤”，消费者几乎已经形成了一种固有的认知，认为AI测肤就是测着玩玩的，并不真的具有参考性。不专业的AI测肤自我祛魅之后，即使消费者应用上了精准专业的AI测肤，也很难形成信任关系。
至于认知失调，是不管专业还是非专业的AI测肤，对于消费者来说他们所提供的信息都是在自己认知范围之外的。“红血丝代表敏感肌”、“皮肤干燥需要补水”，这些信息不管精准与否，其实都是护肤商业体系下商家对于消费者的单方面灌输。对于消费者来说，不管你只是告诉我我皮肤干燥需要补水，还是给我列了一堆复杂的术语数值告诉我我需要补水，结果都是一样的，很难看出其中的专业知识浓度差异。所以专业程度也不能成为消费者被说服的理由。
所以，专业化AI测肤和娱乐化AI测肤同样投入到消费市场中，也不一定能在收益上产生明显的差异。
这样看来，大部分专业AI测肤企业选择的道路还是正确的——避开C端市场，和B端护肤品企业合作。
相比直面消费者，B端企业对于算法的精准程度显然有着更迫切的需求和明确的感知。就像护肤品牌POLA，所提供的皮肤测试非常受消费者欢迎，可皮肤测试的过程非常麻烦，要用取样贴贴在脸上取样，然后跨洋邮寄到POLA在日本的中心，最后还要在实验室中经历十几天的校验才能有结果。如果这种过程能够被AI简化，相信能大大提升POLA皮肤测试服务的效率。
其实AI测肤和所有AI技术一样，适用于那些需要“效率”的地方。机场安检需要提升效率，所以人脸识别得以应用；发布会速记需要提升效率，所以语音识别得以应用。但消费者对于自己皮肤状况的简单认知是不需要提升效率的（照照镜子就能看到的事本身没有效率可言），但B端企业研发护肤品、完成专业皮肤测试等等是需要效率的，所以AI测肤该去哪里，答案也很明了。
6. 甲基化监测
我们实验室用的是SYBR染料法，用qRTPCR来比较不同处理组间目的基因的表达差异。 实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 荧光定量PCR原理 荧光定量PCR最早称TaqMan PCR，后来也叫Real-Time PCR。原理：随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。 荧光定量检测根据所使用的标记物不同可分为荧光探针和荧光染料。荧光探针又包括Beacon技术（分子信标技术，以美国人Tagyi为代表）、 TaqMan探针（以美国ABI公司为代表）和FRET技术（以罗氏公司为代表）等；荧光染料包括饱和荧光染料和非饱和荧光染料，非饱和荧光染料的典型代表就是现在最常用的SYBR GreenⅠ；饱和荧光染料有EvaGreen、LC Green等。 嵌合荧光染料法（SYBR GreenⅠ） SYBR Green I是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，与双链DNA非特异性结合。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合，其荧光增加1000倍。所以，一个反应发出的全部荧光信号与出线的双链DNA量呈比列，且会随扩增产物的增加而增加。 SYBR Green I荧光染料与DNA双链的结合 双链DNA结合染料的优点：实验设计简单，仅需要2个引物，不需要设计探针，无需设计多个探针即可以快速检验多个基因，且能够进行熔点曲线分析，检验扩增反应的特异性，低的初始成本，通用性好，因此国内外在科研中使用比较普遍。 荧光探针法（Taqman 技术）：PCR扩增时，加入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。该探针为一直线型的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR 仪检测不到荧光信号； PCR扩增时（在延伸阶段），Taq 酶的 5' － 3' 切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步，这也是定量的基础所在。 荧光定量PCR的应用 1 核酸定量分析。 对传染性疾病进行定量定性分析，病原微生物或病毒含量的检测 , 比如近期流行的甲型H1N1流感， 转基因动植物基因拷贝数的检测，RNAi 基因失活率的检测等。 2 基因表达差异分析。 比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异 ( 如药物处理、物理处理、化学处理等 ) ，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA芯片或差显结果的确证。 3 SNP 检测。检测单核苷酸多态性对于研究个体对不同疾病的易感性或者个体对特定药物的不同反应有着重要的意义，因分子信标结构的巧妙性，一旦SNP 的序列信息是已知的，采用这种技术进行高通量的 SNP 检测将会变得简单而准确。 4 甲基化检测。甲基化同人类的许多疾病有关，特别是癌症， Laird 报道了一种称作 Methylight的技术，在扩增之前先处理 DNA ，使得未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受影响，用特异性的引物和 Taqman探针来区分甲基化和非甲基化的 DNA ，这种方法不仅方便而且灵敏度更高。 5 产前诊断：人们对遗传性物质改变引起的遗传性疾病还无法治疗，到目前为止，还只能只能通过产前监测，减少病婴出生，以防止各类遗传性疾病的发生，如为减少X连锁遗传病患儿的出生，从孕妇的外周血中分离胎儿DNA，用实时荧光定量PCR检测其Y性别决定区基因是一种无创伤性的方法，易为孕妇所接受。 6 病原体检测：采用荧光定量PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌、EB病毒和巨细胞病毒等病原体进行定量测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。 7 药物疗效考核：对乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV) 定量分析显示：病毒量与某些药物的疗效关系。HCV高水平表达，干扰素治疗作用不敏感，而HCV低滴度，干扰素作用敏感；在拉米夫定治疗过程中，HBV- DNA的血清含量曾有下降，随后若再度上升或超出以前水平，则提示病毒发生变异。 8 肿瘤基因检测：尽管肿瘤发病的机理尚未清楚，但相关基因发生突变是致癌性转变的根本原因已被广泛接受。癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期就可以出现。实时荧光定量 PCR不但能有效地检测到基因的突变，而且可以准确检测癌基因的表达量。目前用此方法进行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病WT1基因、肿瘤 ER基因、前列腺癌PSM基因、肿瘤相关的病毒基因等多种基因的表达检测。
7. 甲基化数据
TCGA收录的基因组测序数据涉及到的癌症达33种，包含的组织类型达26种：
ACC、BLCA、BRCA、CESC、CHOL、COAD、DLBC、ESCA、GBM、HNSC、KICH、KIRC、KIRP、LAML、LGG、LIHC、LUAD、LUSC、MESO、OV、PAAD、PCPG、PRAD、READ、SARC、SKCM、STAD、TGCT、THCA、THYM、UCEC、UCS、UVM。
TCGA是美国国家癌症研究所(National Cancer Institute)和美国人类基因组研究所(National Human Genome Research Institute)共同监督的一个项目，旨在应用高通量的基因组分析技术，以帮助人们对癌症有个更好的认知，从而提高对于癌症的预防、诊断和治疗能力。
作为目前最大的癌症基因信息数据库，TCGA的全面不仅仅体现在众多癌型上(覆盖33种癌症类型，超过30000例肿瘤样本，超过20000个基因的表达信息)，还体现在多组学数据（包括基因表达数据、miRNA表达数据、拷贝数变异、DNA甲基化、SNP等）。
TCGA作为肿瘤研究中资源最丰富，数据最权威的数据库，自然受到广大科研工作者的深入挖掘。无数的文章脱胎于通过挖掘TCGA数据，同时也促使了不计其数的衍生的数据库用于挖掘可视化TCGA这个巨大的资源。
8. 甲基化研究的最新进展
分子诊断技术是指以DNA和RNA为诊断材料，用分子生物学技术通过检测基因的存在、缺陷或表达异常，从而对人体状态和疾病作出诊断的技术。其基本原理是检测DNA或RNA的结构是否变化、量的多少及表达功能是否异常，以确定受检者有无基因水平的异常变化，对疾病的预防、预测、诊断、治疗和预后具有重要意义。通俗简单的讲所有基于分子生物学水平的方法学技术都属于分子诊断技术，比如PCR技术、基因测序技术等等。
PCR技术即聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，基本原理类似于DNA的天然复制过程，由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性，模板DNA与引物的退火(复性)，引物的延伸。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。由1983年美国Mullis首先提出设想，1985年由其发明了聚合酶链反应，即简易DNA扩增法，意味着PCR技术的真正诞生。简单讲PCR技术本质上是针对DNA片段进行扩增放大，通过实时荧光PCR技术使得样本中DNA含量可以检测出来。
基因测序技术即测定DNA序列的技术。在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和 Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生 A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。目前 Sanger测序法得到了广泛的应用。简单讲基因测序技术是针对DNA片段进行测序和分析，使得DNA序列得以清晰。
下面一起来了解一下分子诊断技术近50年的发展历程：
一、基于分子杂交的分子诊断技术
上世纪60年代至80年代是分子杂交技术发展最为迅猛的20年,由于当时尚无法对样本中靶基因进行人为扩增,人们只能通过已知基因序列的探针对靶序列进行捕获检测。其中液相和固相杂交基础理论、探针固定包被技术与cDNA探针人工合成的出现,为基于分子杂交的体外诊断方法进行了最初的技术储备。
(一)DNA印迹技术(Southern blot)
Southern[1]于1975年发明了DNA印迹技术,通过限制性内切酶将DNA片段化,再以凝胶电泳将长度不等的DNA片段进行分离,通过虹吸或电压转印至醋酸纤维膜上,再使膜上的DNA变性与核素标记的寡核苷酸探针进行分子杂交,经洗脱后以放射自显影鉴别待测的DNA片段-探针间的同源序列。这一方法由于同时具备DNA片段酶切与分子探针杂交,保证了检测的特异性。因此,一经推出后便成为探针杂交领域最为经典的分子检测方法,广为运用于各种基因突变,如缺失、插入、易位等,及与限制性酶切片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)的鉴定中。Alwine等[2]于1977年推出基于转印杂交的Northern blot技术也同样成为当时检测RNA的金标准。
(二)ASO反向斑点杂交(allele-specific oligonucleotide reverse dot blot,ASO-RDB)
使用核酸印迹技术进行核酸序列的杂交检测具有极高的特异性,但存在操作极为繁琐,检测时间长的缺点。1980年建立的样本斑点点样固定技术则摆脱了传统DNA印迹需要通过凝胶分离技术进行样本固定的缺点。通过在质粒载体导入单碱基突变的方法,构建了首条等位基因特异性寡核苷酸探针(allele-specific oligonucleotide,ASO),更使对核酸序列点突变的检测成为可能。1986年,Saiki[3]首次将PCR的高灵敏度与ASO斑点杂交的高特异性结合起来,实现了利用ASO探针对特定基因多态性进行分型。其后为了完成对同一样本的多个分子标记进行高通量检测,Saiki[4]又发明了ASO-RDB,通过将生物素标记的特异性PCR扩增产物与固定于膜上的探针杂交显色,进行基因分型、基因突变的检测。该法可将多种寡核苷酸探针固定于同一膜条上,只需通过1次杂交反应,即可筛查待检样本DNA的数十乃至数百种等位基因,具有操作简单、快速的特点,一度成为基因突变检测、基因分型与病原体筛选最为常用的技术。
(三)荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)
FISH源于以核素标记的原位杂交技术,1977年Rudkin[5]首次使用荧光素标记探针完成了原位杂交的尝试。在上世纪8090年代,细胞遗传学和非同位素标记技术的发展将FISH推向临床诊断的实践应用。相比于其它仅针对核酸序列进行检测的分子诊断技术,FISH结合了探针的高度特异性与组织学定位的优势,可检测定位完整细胞或经分离的染色体中特定的正常或异常DNA序列;由于使用高能量荧光素标记的DNA探针,可实现多种荧光素标记同时检测数个靶点。
如今,FISH已在染色体核型分析,基因扩增、 基因重排、病原微生物鉴定等多方面中得到广泛应用。通过比较基因组杂交(comparative genomic hybridization,CGH)与光谱核型分析(spectral karyotyping,SKY)等FISH衍生技术,使其正在越来越多的临床诊断领域中发挥作用。
(四)多重连接探针扩增技术(multiplex ligation dependent probe amplification,MLPA)
MLPA技术于2002年由Schouten等[6]首先报道。每个MLPA探针包括2个荧光标记的寡核苷酸片段,1个由化学合成,1个由M13噬菌体衍生法制备;每个探针都包括1段引物序列和1段特异性序列。在MLPA反应中,2个寡核苷酸片段都与靶序列进行杂交,再使用连接酶连接2部分探针。连接反应高度特异,只有当2个探针与靶序列完全杂交,连接酶才能将2段探针连接成1条完整的核酸单链;反之,如果靶序列与探针序列不完全互补,即使只有1个碱基的差别,就会导至杂交不完全,使连接反应无法进行。连接反应完成后,用1对荧光标记的通用引物扩增连接好的探针,每个探针扩增产物的长度都是唯一的。最后,通过毛细管电泳分离扩增产物,便可对把核酸序列进行检测。由于巧妙地借鉴了扩增探针的原理,MLPA技术最多可在1次反应中对45个靶序列的拷贝数进行鉴定。
该技术具备探针连接反应的特异性与多重扩增探针杂交的高通量特性。经过MRC-Holland公司10余年的发展,MLPA技术已成为涵盖各种遗传性疾病诊断、药物基因学多遗传位点鉴定、肿瘤相关基因突变谱筛查、DNA甲基化程度定量等综合分子诊断体系,是目前临床最为常用的高通量对已知序列变异、基因拷贝数变异进行检测的方法。
(五)生物芯片
1991年Affymetrix公司的Fordor[7]利用其所研发的光蚀刻技术制备了首个以玻片为载体的微阵列,标志着生物芯片正式成为可实际应用的分子生物学技术。时至今日,芯片技术已经得到了长足的发展,如果按结构对其进行分类,基本可分为基于微阵列(microarray)的杂交芯片与基于微流控(microfluidic)的反应芯片2种。
1.微阵列芯片
(1)固相芯片:微阵列基因组DNA分析(microarray-based genomic DNA profiling,MGDP)芯片:将微阵列技术应用于MGDP检测中已有超过十年的历史,其技术平台主要分为2类,即微阵列比较基因组杂交(array-based comparative genome hybridization,aCGH)和基因型杂交阵列(SNP array)。顾名思义,aCGH芯片使用待测DNA与参比DNA的双色比对来显示两者间的拷贝数变异(CNV)的变化,而单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)芯片则无需与参比DNA进行比较,直接通过杂交信号强度显示待测DNA中的SNP信息。随着技术的不断进步,目前市场上已出现可同时检测SNP与CNV的高分辨率混合基因阵列芯片。MGDP芯片主要应用于发育迟缓、先天性异常畸形等儿童遗传病的辅助诊断及产前筛查。经验证,使用MGDP芯片进行染色体不平衡检测与FISH的诊断符合率可达100%[8],表达谱芯片(gene expression profiling array,GEP array):1999年,Duggan等[9]首次使用cDNA芯片绘制了mRNA表达谱信息。随着表观遗传学在疾病发生发展中的作用日益得到重视,目前也已出现microRNA芯片、长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)芯片等。类似于MGDP芯片,GEP芯片使用反转录后生成的cDNA文库与固定于芯片载体上的核酸探针进行杂交,从而检测杂交荧光信号的强度判断基因的表达情况。相较于基因组杂交,GEP芯片对生物学意义更为重要的转录组信息进行检测,对疾病的诊断与预后判断具有特殊的意义。目前使用GEP芯片对急性髓细胞白血病、骨髓增生异常综合征等血液病及神经退行性变等进行诊断、分类及预后评估已经获得了令人满意的效果;
(2)液相芯片:传统固相芯片将检测探针锚定于固相载体上捕获目的序列,而Luminex公司的xMAP技术[10]则通过搭配不同比例的2种红色荧光染料,将聚苯乙烯微球标记为不同的荧光色,并对其进行编码得到具有上百种荧光编号的微球。通过xTAG技术将不同的特异性杂交探针交联至编码微球上,使得不同的探针能够通过微球编码得以区分。利用混合后的探针-微球复合物与待测样本进行杂交,使微球在流动鞘液的带动下通过红绿双色流式细胞仪,其中红色激光检测微球编码,绿色荧光检测经杂交后核酸探针上荧光报告基团的信号强度,一次完成对单个样本中多种靶序列的同时鉴定。目前,该技术已在囊性纤维化等遗传性疾病诊断、多种呼吸道病毒鉴定及人乳头瘤病毒分型取得了广泛的应用。
2.微流控芯片
1992年Harrison等[11]首次提出了将毛细管电泳与进样设备整合到固相玻璃载体上构建“微全分析系统”的构想,通过分析设备的微型化与集成化,完成传统分析实验室向芯片上实验室(lab-on-chip)的转变。微流控芯片(microfluidic chip)由微米级流体的管道、反应器等元件构成,与宏观尺寸的分析装置相比,其结构极大地增加了流体环境的面积/体积比,以最大限度利用液体与物体表面有关的包括层流效应、毛细效应、快速热传导和扩散效应在内的特殊性能,从而在1张芯片上完成样品进样、预处理、分子生物学反应、检测等系列实验过程。
目前使用微流控芯片进行指导用药的多基因位点平行检测是主要临床应用领域。
二、核酸序列测定
测序反应是直接获得核酸序列信息的唯一技术手段,是分子诊断技术的一项重要分支。虽然分子杂交、分子构象变异或定量PCR技术在近几年已得到了长足的发展,但其对于核酸的鉴定都仅仅停留在间接推断的假设上,因此对基于特定基因序列检测的分子诊断,核酸测序仍是技术上的金标准。
(一)第1代测序
1975年Sanger与Coulson发表了使用加减法进行DNA序列测定的方法,随后Maxam在1977年提出了化学修饰降解法的模型,为核酸测序时代的来临拉开了序幕。
Sanger等于同年提出的末端终止法(Sanger测序法)利用2'与3'不含羟基的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)进行测序引物延伸反应,ddNTP在DNA合成反应中不能形成磷酸二酯键,DNA合成反应便会终止。如果分别在4个独立的DNA合成反应体系中加入经核素标记的特定ddNTP,则可在合成反应后对产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)及放射自显影,根据电泳条带确定待测分子的核苷酸序列。Appied Biosystems公司在Sanger法的基础上,于1986年推出了首台商业化DNA测序仪PRISM 370A,并以荧光信号接收和计算机信号分析代替了核素标记和放射自显影检测体系。该公司于1995年推出的首台毛细管电泳测序仪PRISM 310更是使测序的通量大大提高。Sanger测序是最为经典的一代测序技术,仍是目前获取核酸序列最为常用的方法。
(二)第2代测序
1.焦磷酸测序(Pyro-sequencing)
不同于Sanger测序法所使用的合成后测序理念,Ronaghi分别于1996年与1998年提出了在固相[13]与液相[14]载体中通过边合成边测序的方法-焦磷酸测序。其基本原理是利用引物链延伸时所释放的焦磷酸基团激发荧光,通过峰值高低判断与其相匹配的碱基数量。由于使用了实时荧光监测的概念,焦磷酸测序实现了对特定位点碱基负荷比例的定量,因此在SNP位点检测、等位基因(突变)频率测定、细菌和病毒分型检测方面应用广泛。由于荧光报告原理不同,其对于序列变异的检测灵敏度从Sanger测序的20%提高到了5%。但由于该技术的仪器采购与单次检测成本较高,目前尚未得到大规模的临床使用。
2.高通量第2代测序
目前常见的高通量第二代测序平台主要有Roche 454、Illumina Solexa、ABI SOLiD和Life Ion Torrent等,其均为通过DNA片段化构建DNA文库、文库与载体交联进行扩增、在载体面上进行边合成边测序反应,使得第1代测序中最高基于96孔板的平行通量扩大至载体上百万级的平行反应,完成对海量数据的高通量检测。该技术可以对基因组、转录组等进行真正的组学检测,在指导疾病分子靶向治疗、绘制药物基因组图谱指导个体化用药、感染性疾病的病原微生物宏基因组鉴定及通过母体中胎儿DNA信息进行产前诊断等方面已经取得了喜人的成绩。然而,由于该技术需要对DNA进行片段化处理,测序反应读长较短(如Solexa与SOLiD系统单次读长仅50bp),需要对数据进行大规模拼接,因此对分子诊断工作者掌握生物信息学知识提出了更高要求,以利于后期的测序数据分析。
(三)第3代测序
第3代测序技术的核心理念是以单分子为目标的边合成边测序。该技术的操作平台目前主要有Helicos公司的Heliscope、Pacific Biosciences公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔技术等。该技术进一步降低了成本,可对混杂的基因物质进行单分子检测,故对SNP、CNV的鉴定更具功效。但是目前其进入产品商业化,并最终投入临床应用仍有很长的距离。
三、基于分子构象的分子诊断技术
(一)变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)与单链构象多态性(single strand conformation polymorphism,SSCP)
1970~1980年间,Fischer等[15]与Orita等[16]分别提出了利用核酸序列变异所导至双链变性条件差异与单链空间折叠差异,通过变性与非变性PAGE对变异序列进行分离鉴定的方法,即DGGE与SSCP。上述2项技术均通过变异核酸分子在空间构象上的差异,通过特定条件下电泳速率的变化进行检测。正因为核酸分子构象具有序列特异性,且对于序列的改变非常敏感,常常1个碱基的变化也能得到鉴定。但由于DGGE与SSCP均必须进行PCR后开盖电泳的操作,现已不常见于临床检测。
(二)变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,dHPLC)
1997年,Oefner和Underhill建立[17,18]了利用异源双链变性分离变异序列、使用色谱洗脱鉴定的技术,称为dHPLC,可自动检测单碱基置换及小片段核苷酸的插入或缺失。对于存在一定比例变异序列的核酸双链混合物,其经过变性和复性过程后,体系内将出现2种双链:一种为同源双链,由野生正义链-野生反义链或变异正义链-变异反义链构成的核酸双链;另一种为异源双链,即双链中1条单链为野生型,而另1条为变异型。由于存在部分碱基错配的异源双链 DNA与同源双链DNA的解链特征不同,在相同的部分变性条件下,异源双链因存在错配区而更易变性,被色谱柱保留的时间短于同源双链,故先被洗脱下来,从而在色谱图中表现为双峰或多峰的洗脱曲线。由于该技术使用了较高分析灵敏度的色谱技术进行检测,可快速检出<5%负荷的变异序列。但需注意的是,由于该技术主要通过异源双链进行序列变异检测,其不能明显区分野生型与变异型的纯合子。
(三)高分辨率熔解分析(high-resolution melting analysis,HRMA)
2003年,Wittwer等[19]首次革命性地使用过饱和荧光染料将PCR产物全长进行荧光被动标记,再通过简单的产物熔解分析对单个碱基变化进行鉴定。该技术的原理也是通过异源双链进行序列变异鉴定。待测样本经PCR扩增后,若存在序列变异杂合子,则形成异源双链,其熔解温度大大下降。此时由于双链被饱和染料完全填充,其产物熔解温度的变化便可通过熔解曲线的差异得以判定。对于变异纯合子而言,HRMA也可利用其较高的分辨率完成PCR产物单个位点A:T双键配对与G:C三建配对热稳定性差异的鉴定,但是对于Ⅱ、Ⅲ类SNP的纯合子变异则无法有效区分。
如何利用DNA构象对序列进行推测,从而避免成本较高的序列测定或操作繁琐的杂交反应一直是分子生物学研究与应用的热点问题。目前,使用构象变化对序列变异进行间接检测的便捷性已得到一致肯定,尤其是HRMA可完成对变异序列单次闭管的扩增检测反应。但需要注意的是,由于基于构象变化的分子检测手段多无法通过探针杂交或核酸序列测定对检测的特异性进行严格的保证,因此其只适合大规模的初筛,而真正的确诊仍需要进行杂交或测序的验证。
四、定量PCR(quantitative PCR,qPCR)
相比于其他分子诊断检测技术,qPCR具有2项优势,即核酸扩增和检测在同一个封闭体系中通过荧光信号进行,杜绝了PCR后开盖处理所带来扩增产物的污染;同时通过动态监测荧光信号,可对低拷贝模板进行定量。正是由于上述技术优势,qPCR已经成为目前临床基因扩增实验室接受程度最高的技术,在各类病毒、细菌等病原微生物的鉴定和基因定量检测、基因多态性分型、基因突变筛查、基因表达水平监控等多种临床实践中得到大量应用。但伴随着qPCR技术的迅猛发展,有关这项技术的质量管理问题也日益突出,如何消除各类生物学变量所引起的检测变异,减少或抑制实验操作与方法学中的各种干扰因素是qPCR技术面临的难题。
(一)实时荧光定量PCR(real-time PCR)
1.双链掺入法
1992年Higuchi等[20-21]通过在PCR反应液中掺入溴乙锭对每个核酸扩增热循环后的荧光强度进行测定,提出了使用荧光强度与热循环数所绘制的核酸扩增曲线,定量反应体系中初始模板的反应动力学(real-time PCR)模型,开创了通过实时闭管检测荧光信号进行核酸定量的方法。核酸染料可以嵌入DNA双链,且只有嵌入双链时才释放荧光,在每1次的扩增循环后检测反应管的荧光强度,绘制荧光强度-热循环数的S形核酸扩增曲线,以荧光阈值与扩增曲线的交点在扩增循环数轴上的投影作为循环阈值(Cycle threshold,Ct),则Ct与反应体系中所含初始模板数量呈负指数关系,推断初始模板量。随后Morrison[22]提出了使用高灵敏度的双链染料SYBR Green I进行反应体系中低拷贝模板定量的方法。这一方法操作简便,但由于仅使用扩增引物的序列启动核酸扩增,其产物特异性无法得到充分保证。虽然在实时荧光定量PCR反应后可通过熔解曲线对产物特异性进行检验,但其特异性明显逊于使用荧光探针进行检测,因此双链掺入法并未在临床实践中得到认可。
2.Taqman探针
由于双链掺入法存在特异性较低的问题,1996年Heid[23]综合之前发现的Taq酶的5'核酸酶活性与荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)探针的概念提出了使用Taqman探针进行qPCR的方法。TaqMan探针的本质是FRET寡核苷酸探针,在探针的5'端标记荧光报告基团,3'端标记荧光淬灭基团,利用Taq酶具有5'3'外切酶活性,在PCR过程中水解与靶序列结合的寡核苷酸探针,使荧光基团得以游离,释放荧光信号。从而使能够与靶序列杂交的探针在扩增过程中释放荧光,通过real-time PCR的原理对其进行定量。由于其超高的特异性与成功的商品化推广,Taqman探针已经成为目前临床使用最为广泛的qPCR方法,其在各种病毒基因定量检测、基因分型、肿瘤相关基因表达检测等方面具有着不可替代的地位。
3.分子信标
同样在1996年,Tyagi等[24] 提出了使用分子信标(moleuclar beacons)进行qPCR的方法,分子信标是5'与3'端分别标记有荧光报告基团与淬灭基团的寡核苷酸探针,其两端具有互补的高GC序列,在qPCR反应液中呈发夹结构,荧光基团与淬灭基团发生荧光共振能量转移(FRET)而保持静息状态。当PCR反应开始后,茎环结构在变性高温条件下打开,释放荧光;在退火过程中,靶序列特异性探针则与模板杂交保持线性,不能与模板杂交的探针则复性为茎环结构而荧光淬灭,通过检测qPCR体系中退火时的荧光信号强度,便可以real-time PCR原理特异性检测体系中的初始模板浓度。相比于Taqman探针,分子信标使用发卡结构使荧光基团与淬灭基团在空间上紧密结合,大大降低了检测的荧光背景,其检测特异性较Taqman探针更高,更适合等位基因的分型检测。
4.双杂交探针
1997年,Wittwer等[25]发表了使用分别标记荧光供体基团与荧光受体基团的2条相邻寡核苷酸探针进行qPCR的方法。双杂交探针所标记的供体基团和受体基团的激发光谱间具有一定重叠,且2条探针与靶核酸的杂交位置应相互邻近。仅当2条探针与靶基因同时杂交时,供体与受体基因得以接近,从而通过FRET发生能量传递,激发荧光信号,荧光信号强度与反应体系中靶序列DNA含量呈正比。由于使用了2条探针进行靶序列杂交,该方法的特异性比传统单探针检测体系得到了极大地提升。
(二)数字PCR
早在上世纪90年代就出现了使用微流控阵列对单次qPCR反应进行分散检测的概念。基于这一理念,Vgelstein与Kinzter[26]于1999年发表了数字PCR(digital PCR)的方法,对结肠癌患者粪便中的微量 K-RAS基因突变进行了定量。相比于传统的qPCR方法,数字PCR的核心是将qPCR反应进行微球乳糜液化,再将乳糜液分散至芯片的微反应孔中,保证每个反应孔中仅存在≤1个核酸模板。经过PCR后,对每个微反应孔的荧光信号进行检测,存在靶核酸模板的反应孔会释放荧光信号,没有靶模板的反应孔就没有荧光信号,以此推算出原始溶液中待测核酸的浓度。因此,数字PCR是1种检测反应终点荧光信号进行绝对定量的qPCR反应,而非以模板Ct值进行核酸定量的real-time PCR。
经由Quantalife公司开发(已于2011年被BIO-RAD收购)的微滴式数字PCR是首款商品化的数字PCR检测系统,目前已被广泛运用于微量病原微生物基因检测、低负荷遗传序列鉴定、基因拷贝数变异与单细胞基因表达检测等多个临床前沿领域。与传统qPCR相比较,该技术具有超高的灵敏度与精密度,使其成为目前qPCR领域的新星。
五、对未来5年的展望
半个世纪以来分子诊断的高速发展离不开分子生物学技术日新月异的进步。概而言之,在过去的50年中分子诊断技术取得了三大转化与3项提升:即报告信号检测从放射核素标记向荧光标记转化,操作方法由手工操作向全自动化转化,检测分析通量从单一标志物向高通量多组学联合判断转化;检测灵敏度、精密度、特异性的快速提升。
在未来5年中,我国分子诊断事业将迎来两方面的进步。随着卫生监管部门对分子诊断重要性的认识不断深入与越来越多高学历、高素质人才的进入,分子诊断将会出现理念的革命性进步,高通量技术将更多的进入临床的实际应用中。随着技术的进一步发展,传统针对特定基因异常、病原微生物感染鉴定的方法学,也将在检测的各项分析性能与操作便捷程度上取得长足的进步。对于传统人力与时间成本较高的检测方法学,将出现两极分化的态势,即Southern等经典的检测金标准将得到保留;而ASO-RDB等灵敏度、特异性均不能满足实际临床需求的方法将快速被新型技术所取代。最终,分子诊断也必将一改目前仅仅用于病原微生物基因检测与部分遗传性疾病诊断的局面,形成由肿瘤学、遗传学、微生物学、药物基因组学四足鼎立,快速发展的景象。
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