1. 蛋白质抽提试剂
主要成分是:NaCl,Tris-HCl(PH=8),EDTA(PH=8),SDS.NaCl,Tris-HCl主要是调节溶液的PH,维持一定的离子浓度.EDTA主要是二价金属离子的螯合剂,使影响DNA的DNA酶中的钙离子和镁离子和EDTA结合,使酶失去活性,有利于提取完整DNA;
SDS主要是和蛋白质结合,使其变形沉淀,从而利于DNA的提取,减少和清除带白质杂质!
2. 蛋白质提纯实验
1. 避免冷冻干燥 尽管有一些蛋白是经冷冻干燥处理后长出了晶体,但是大多数情况下并非如此。所以要尽可能避免冷冻干燥。如果蛋白已经这样了,准备点晶体之前,要用水或者缓冲液透析,除掉非挥发性的试剂和其他化学物质。
2. 避免硫酸铵沉淀 避免硫酸铵沉淀法作为纯化的最后一步或使用硫酸铵沉淀法来浓缩蛋白。因为硫酸铵很难除干净,对后续的结晶过程造成干扰。残存的微量的硫酸铵也会干扰晶体筛选的条件,造成结果的不可重复性。微量的硫酸铵也容易造成样品沉淀,以及在PEG和盐类物质存在时会出现过量的晶核。
3. 蛋白批次 在同一次条件筛选时,要避免样品不是同一批次纯化出来的。每一次纯化的条件和步骤都是不同的〔就像天下没有两片相同的树叶(Redondo添加)〕,所以筛选的时候应该使用同一批次纯化出来的蛋白。
4. 定性蛋白质 在拿去点晶体之前,应该定性判断你纯化出来的蛋白是不是你的目的蛋白。根据确定了的蛋白质性质,可以给筛选和优化提供参考。常用的蛋白质定性试验包括: SDS-PAGE Native PAGE Dynamic Light Scattering IEF (Isoelectric Focusing) Gel Mass Spectroscopy 根据这些试验的结果,我们可以判断: 蛋白样品的纯度 蛋白样品的同次性 不同批次纯化出来的蛋白的性质差异 蛋白质的稳定性
5. 蛋白需要达到什么纯度? 要拿去筛晶体,蛋白样品需要达到什么纯度?答案是越纯越好。但是这样一个答案不能让人满意。如何能更容易理解一些呢?一开始筛选时,根据考马斯亮蓝染色判断蛋白纯度应该达到90 到 95%。不过,考虑到总有进一步纯化的步骤,不可能达到‘绝对’的100%纯,所以没有必要追求‘绝对’纯,存在一点点的杂质蛋白是可以接受的。还要记住,结晶本身就是一个纯化过程。当筛选过程中没有晶体长出,甚至没有长的迹象,或者在优化条件时不能进一步提高晶体的质量了,这个时候就要考虑进一步提高蛋白浓度了。
6. 样品的保存 一般蛋白都可以在4°C 或 -70°C保存。与制备样品的人交流一下或者查阅文献中报道的类似蛋白的保存方法,选择一个合适的缓冲液体系和保存温度。在保存之前,应该测定蛋白的活性和稳定性,并隔一段时间取出一点蛋白来测定其活性是否改变及有没有降解发生。反复冻溶对蛋白是不利的,应尽量避免。样品应该分装成小份,每次取出当次试验需要的量,保证取出来的正好用完。有时候,一些人喜欢加入甘油(10 to 50% v/v)来保护蛋白不被冻伤。但是应该尽量避免加入甘油,因为甘油很难通过透析或者过滤来除干净,残存的甘油会给长晶体带来变数。甘油在不同条件下可能是沉淀剂,也可能是additive(促溶剂?)或冷冻保护剂。一般来讲,蛋白浓度越高越利于保存。但是,当蛋白浓度很高时,保存期间也容易产生沉淀。将保存的蛋白做好标记,是何批次纯化的,蛋白浓度多高,以及保存的时间等。将同一个批次的蛋白分装好保存到同一个大的离心管里,这样方便管理。
7. 蛋白样品操作中要注意的 Be nice to your protein.要记得蛋白可是微生物们的美餐,不要让它们偷吃了你的蛋白。平时,蛋白一定要在4° C或更低温度放置,暴露在室温的时间要尽可能地短。当溶化一个蛋白样品或将冷冻干燥的蛋白复溶的时候,不要摇晃或震荡,不要产生气泡,出现气泡往往标志着蛋白变性了。当确定了点晶体时操作间的温度,应预先将蛋白样品在这个温度放
3. 测定某一种组织抽提物的蛋白质含量用什么方法合适
酵母抽提物是一种天然调味料,主要成分为多肽、氨基酸、呈味核苷酸、B族维生素及微量元素。
酵母抽提物具有纯天然、营养丰富、味道鲜美醇厚等优点,广泛应用于方便面(粉)、鸡精、肉制品、复合调味料、酱油、蚝油、酱类、卤制品、火锅料、休闲食品等产品中。
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4. 蛋白质的检验试剂
最简单的方法,也是人们最耳熟能详的方法,就是对物体进行灼烧,看是否能闻到烧焦的羽毛味,如果可以闻到烧焦的羽毛味,那么证明有蛋白质的存在。
中学的化学课上也教过我们不少的方法,比如说吧蛋白质和浓HNO3进行反应,如果能够变性产生黄色不溶性物质,那么该物体是蛋白质。
还有一种方法就是把含有蛋白质的屋子磨成浆然后过滤,取滤液进行测试,可以先在滤液中加氢氧化钠(NaOH),然后再加入双缩脲试剂,如果出现紫色反应,就为蛋白质。
除了比较通用的方法,还有一些高大上的方法也可以检测鉴定蛋白质,比如通过质谱仪,它的原理主要是根据肽质量指纹图谱与蛋白质数据库中蛋白质的理论PMF进行比对,从而鉴定蛋白质。除了比较通用的方法,还有一些高大上的方法也可以检测鉴定蛋白质,比如通过质谱仪,它的原理主要是根据肽质量指纹图谱与蛋白质数据库中蛋白质的理论PMF进行比对,从而鉴定蛋白质。
5. 膜蛋白抽提试剂
目前核酸检测试剂常见的国产种类有这几种:
一,杂交捕获免疫荧光法,保存温度:2-30℃;
二,乳胶法,保存温度:4-30℃;
三,酶联免疫法,保存温度:2-8℃;
四,胶体金法,保存温度:2-30℃;
五,荧光PCR法,保存温度:-205℃;
六,化学发光法,保存温度:2-8℃;
七,双扩增法,保存温度:A盒-40到-15℃,B盒2-8℃;
八,RNA捕获探针法,保存温度:A盒2-8℃,B盒低于-15℃;
九,荧光免疫层析法,保存温度:4-30℃;
十,磁微粒化学发光法,保存温度:2-8℃;
十一,稀土纳米荧光免疫层析法,保存温度:2-30℃;
十二,上转发光免疫层析法,保存温度:2-30℃。
6. 提蛋白的试剂盒
质粒抽提
质粒抽提方法即去除 RNA,将质粒与细菌基因组 DNA分开,去除蛋白质及其它杂质,以得到相对纯净的质粒。
提取质粒DNA的方法有很多种,从提取产量上分可分为微量提取、中量提取、大量提取,从使用仪器上分可分为一般提取和试剂盒方法提取,从具体操作方法分可以分为碱裂解法、煮沸法、牙签法等,各种不同的方法各有其优缺点,根据不同的实验目的可以采用合适的提取方法。
7. 蛋白质抽提试剂的目的
可以用氯仿抽提之后离心啊,这样的话,离心后分三层,下层有机层中有一些脂溶性的杂质,中间层白色絮状沉淀是蛋白,上清液中即含有核酸;现在也有很多试剂盒,是可以把核酸挂在柱子上,把蛋白质等杂质离心掉,这个方法即快捷又方便,但好像对RNA的话,效果不太好
8. 组织蛋白抽提试剂
线粒体提取试剂盒用于从动物细胞或组织中分离出完整而纯化的线粒体。适合于动物软组织(肝或脑组织)和硬组织(肌肉)以及培养细胞的线粒体的制备。其制备物产量高,可以被用于细胞凋亡、信号传递、代谢和蛋白组学等的研究。 索莱宝的线粒体提取试剂盒使用方便,具体也可以到官网下载说明书看看,那个比较详细。
9. 蛋白质提取试剂
蛋白质用双缩脲试剂检测。 双缩脲试剂是一个用于鉴定蛋白质的分析化学试剂。它是一个碱性的含铜试液,呈蓝色,由0.1g/mL氢氧化钠或氢氧化钾、0.01g/mL硫酸铜和酒石酸钾钠配制。会遇到蛋白质显紫色。 双缩脲试剂本是用来检测双缩脲,由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键,因此也能与铜离子在碱性溶液中发生双缩脲反应。
当底物中含有肽键时(多肽),试液中的铜与多肽配位,络合物呈紫色。
可通过比色法分析浓度,在紫外可见光谱中的波长为540nm。鉴定反应的灵敏度为5-160mg/ml。
双缩脲试剂中真正起作用的是硫酸铜,而氢氧化钾仅仅是为了提供碱性环境,因此它可被其他碱,如氢氧化钠所代替。
向试剂中加入碘化钾,会延长试剂的使用寿命。
酒石酸钾钠的作用是保护反应生成的络离子不被析出变为沉淀,从而使试剂失效。
10. 蛋白质的抽提原理和方法
大豆分离蛋白的提取方法有碱溶酸沉法、膜分离法、吸附法和醇溶法;大豆浓缩蛋白的提取方法有稀酸沉淀法和醇洗法;大豆组织蛋白的提取方法有挤压膨化法、纺丝法。