GE蛋白纯化试剂盒(蛋白质纯化试剂盒)

1. 蛋白质纯化试剂盒

1、根据蛋白的特性，一般可以有以下5种纯化方法。目前平台配备的主要是前四种层析纯化的各种凝胶柱。反相层析技术在一般的蛋白纯化中较少使用，下面将详细介绍常用的前四种层析技术原理及特点。

2、凝胶过滤层析，根据大小和形状分离，这种分离方式是非吸附性的，整个分离过程中只需要一种缓冲液，实验操作方便。在峰谱图中，出峰顺序是：大分子先流出层析柱，小分子后出。

3、离子交换层析，不同蛋白质的等电点（pI，isoelectric point）特性，使在不同pH缓冲液条件下所带正／负净电荷不同，选择不同的离子交换柱实现分离。离子交换层析属于吸附性分离方式，纯化过程中它具有可逆、操控性强及实现样品浓缩等特点。在精纯实验中是常与其它方法相结合使用的主要技术。

4、亲和层析，通过生物分子之间的特异性相互作用来实现分离的层析方法。亲和层析具有高选择性、高纯度、快速、浓缩等特点，在重组蛋白的分离中多作为第一步的粗纯，实现对绝大部分杂质蛋白的去除。

5、疏水相互作用层析，依据生物分子间疏水性差别实现分离的一种层析方式。高离子强度下，增进蛋白质中的疏水性氨基酸与层析介质间的疏水性相互作用，削弱其静电作用力。洗脱时，降低流动相离子强度，削弱蛋白质分子与层析介质间的疏水作用，实现目的蛋白的纯化和收集。

6、疏水作用层析也属于吸附性分离方式，对具有疏水特性的目的蛋白具有高选择性和浓缩等特点。

2. 蛋白浓缩试剂盒

1. 琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段,任何类型或等级的琼脂糖都可以使用.我们强烈的建议您使用新鲜的TAE Buffer作为电泳缓冲液.不要重复使用电泳缓冲液,因为会因其PH的升高而减少产量.新鲜的TBE也可以用,但只能得到较低的产量.　　

2. 当所需DNA片段完全分离时,转移凝胶至紫外灯上,尽可能快地把所需的DNA片段切下来.　　注:切胶时尽量把多余的凝胶切去,DNA曝露在紫外灯下不能超过30秒.　　

3. 将带有目的片段的凝胶块转移至1.5ml离心管(离心管已经称重了)中,称重得出凝胶块的重量.近似地确定其体积.假设其密度为1g/ml(几乎所有DNA凝胶的密度都可以近似为1g/ml),于是凝胶块的体积便可通过如下方法得到:凝胶薄片的重量为0.2g, 则其体积为　　0.2 ml.加入等体积的Binding Buffer(XP2),于55-65℃水浴中温浴7min或至凝胶完全融化,每2-3 min振荡或涡旋混合物.　　重要提醒:在凝胶完全溶解之后,注意凝胶-Binding buffer混和物的pH值.如果其pH值大于8的话,DNA的产量将大大减少.观察混和物的颜色,如果是橙色或红色,则要加入5 ul 浓度为5 M,pH为5.2的醋酸钠,以调低其pH值.经过这一调节,该混合物的颜色将恢复为正常的浅黄色.　　

4. 取一个干净的HiBind DNA Mini柱子装在一个干净的2ml收集管内(已备好).　　

5. 将第三步获得的DNA/熔胶液全部转移至柱子中.室温下10,000 x g离心1分钟.弃收集管中的滤液,将柱子套回2ml收集管内.　　

6. 如果DNA/凝胶熔液的体积超过700ul,一次只能转移700ul至柱子中,余下的可继续重复第5步至所有的溶液都经过柱子.每一个Hibind DNA回收纯化柱都有一个极限为25gDNA的吸附能力.如果预期产量较大,则把样品分别加到合适数目的柱子中.　　

7. 弃收集管中的滤液,将柱子套回2ml收集管内.移300ul Binding Buffer(XP2)至柱子中,室温下, 10,000 x g下离心1min.　　

8. 弃收集管中的滤液,将柱子套回2ml收集管内.移700ul SPW Wash buffer(已用无水乙醇稀释的)至柱子中.室温下10,000xg离心1min.　　注意:浓缩的SPW Wash Buffer 在使用之前必须按标签的提示用乙醇稀释.如果DNA 洗涤缓冲液在使用之前是置于冰箱中的,须将其拿出置于室温下.　　

9. 重复用700ul SPW Wash buffer洗涤柱子.室温下10,000xg离心1min.　　

10. 弃收集管中的滤液,将柱子套回2ml收集管内.室温下,13,000 x g离心2 min以甩干柱子基质残余的液体.　　

11. 把柱子装在一个干净的1.5ml离心管上,加入15~30ul(具体取决于预期的终产物浓度)的Elution Buffer(或TE缓冲液)到柱基质上,室温放置1min, 13,000xg离心1min以洗脱DNA.　　第一次洗脱可以洗出70-80%的结合DNA. 如果再洗脱一次的话,可以把残余的DNA洗脱出来,不过那样的浓度就会较低.

3. 蛋白生物素化试剂盒

性质：

外商独资·外企办事处

规模：

100-499人

行业：

其他行业

总部位于美国马里兰州Bethesda，专注于高质量细胞因子/重组蛋白的开发与生产。中国公司成立于2010年，并已在北京经济技术开发区建成研发中心。

主要产品有肿瘤靶点蛋白、生物素标记蛋白、抑制剂筛选试剂盒、Fc 受体蛋白、生物标志物蛋白、CD抗原、细胞因子等。

4. 蛋白纯化试剂盒说明书

girard试剂指的是吉拉德试剂T易溶于水，用三甲胺、氯乙酸乙酚和脱在无水乙醇中制取。 用作酮类化合物的分离纯化试剂(即利用酞肪基与酮拨基反应，生成水溶性衍生物。后者经酸水解，可获原酮类化合物)。

5. 蛋白质结晶试剂盒

RIPA裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组

DNA等的复合物。在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。

6. 蛋白质纯化试剂盒图片

柱纯化是蛋白纯化最高效的方法。

首先我们需要一个带有特定标签的柱子，也可能是阴离子柱，阳离子柱或者层析柱。

然后要一台纯化仪，我们实验室的是bio-red，其实最好的纯化仪是AKTA的，很耐折腾，bio-red的太敏感，大量纯化是容易出问题。

其他的仪器就是纯化后工作，比如纯化好的蛋白保存，可能会用到冷冻干燥。

对了，还有一个，就是SDS-PAGE蛋白电泳仪，用来检测蛋白是否表达，是否完全破碎，纯化后是否有杂蛋白等等。

其他的就没有了。。

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7. 蛋白质纯化试剂盒使用方法

双缩脲试剂是一个用于鉴定蛋白质的分析化学试剂。 它是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由0.1g/mL氢氧化钠或氢氧化钾、0.01g/mL硫酸铜和酒石酸钾钠配制。会遇到蛋白质显紫色。 双缩脲试剂本是用来检测双缩脲，由于蛋白质分子中含有很多与双缩脲结构相似的肽键，因此也能与铜离子在碱性溶液中发生双缩脲反应。

当底物中含有肽键时（多肽），试液中的铜与多肽配位，络合物呈紫色。

可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长为540nm。鉴定反应的灵敏度为5-160mg/ml。

双缩脲试剂中真正起作用的是硫酸铜，而氢氧化钾仅仅是为了提供碱性环境，因此它可被其他碱，如氢氧化钠所代替。

向试剂中加入碘化钾，会延长试剂的使用寿命。

酒石酸钾钠的作用是保护反应生成的络离子不被析出变为沉淀,从而使试剂失效。需要注意的是，能与双缩脲试剂发生紫色反应的化合物分子中至少含有两个肽键。因此，二肽无法用它来检验。

8. 蛋白质提取试剂盒

斐林试剂中乙液为0.05g/ml的CuSO4溶液，双缩脲试剂中CuSO4溶液为0.01g/ml，后者的浓度小，用量也只有一滴。

蛋白质的肽键在碱性溶液中能与Cu2+络合成紫红色的化合物，因此蛋白质与斐林试剂会反应，但是斐林试剂浓度过高的CuSO4在碱性溶液中会生成大量的蓝色的Cu(OH)2沉淀，遮蔽蛋白质反应所产生的紫色，所以实验现象看不出来。因此斐林试剂和双缩脲试剂不能混用。

9. 白蛋白试剂盒

我们应用PCR技术，放大EHP的18SrRNA基因，再用标记地可辛的探针探测原位杂交细胞中被感染的EHP，最后开发新的PCR技术探测对虾组织，排泄物和水中的EHP。

2.材料和方法

2.1对虾

2006年在文莱收集了感染对虾肠孢子虫（EHP）的南美兰对虾。2014年和2015年在越南虾塘里收集了感染EHP的南美白对虾。2014年，从泰国运送了一批南美兰对虾到我们亚利桑那大学的实验室进行隔离检测，这些对虾后来被检测出感染了EHP，它们的肝胰腺，排泄物和水进行了PCR技术取样检测。

为了检测原位杂交（ISH），并通过PCR技术分析EHP的特异性，研究人员使用了具有棉虾病临床症状的斑节对虾样本，这些对虾来自2005年（固定组织）和2006年（冰冻组织）的马达加斯加。还使用了感染了鳄组织变形虫的南美白对虾，这些虾是在2014年收集到的。通过PCR技术分析，肝胰腺组织或者整只对虾被保护在95%的酒精当中或被风干后送往我们实验室。通过原位杂交技术，用戴维森固定法将虾固定。

2.2.DNA提取

从感染EHP的对虾中去除肝胰腺，（4-5只虾）放进一个样本中。装运感染EHP的对虾的虾槽中对排泄物和水进行了取样。利用MicrosepAdvance离心装置（PALL公司）将虾槽里的水浓缩150倍，用于DNA提取。用一种高纯度DNA模板制备工具（RocheBioscience）或Maxwell-16Cell LEV DNA纯化试剂盒（Promega）。

为了测试EHP引物的特异性，PCR扩增检测两种寄生虫病中的DNA：

（1）棉虾病，2006年从马达加斯加收集了斑节对虾，这些虾的肌肉变白，通过rRNA基因测序，发现它们的DNA呈阴性，因为内有类似于匹里虫的微孢子虫（GenBankkp825331号）；

（2）变形虫病，这些南美白对虾大量死亡，通过组织学检查，最后发现这些虾感染了变形虫（种类不确定）。

为了保证EHP引物没有宿主基因组的反应，制备DNA模板：

（1）来自美国夏威夷的无特定病原（SPF）的南美白对虾（>10样本）、斑节对虾（3个样本）；

（2）来自沙特阿拉伯的印度对虾（2个样本）；

（3）在新喀里多尼亚养殖的南美兰对虾（2个样本）；

（4）来自菲律宾的罗氏沼虾（2个样本）；

（5）沙特阿拉伯附近虾塘里采集的蟹（7个样本，未知的物种）；

（6）多毛类（3个样本），卤虫生物量（9个样本），鱿鱼（2个样本），磷虾（2个样本），这些是从各种商业供应商运送。

2.3.18S rRNA基因扩增和克隆

PCR检测技术，使用了PuReTaqReady-To-Go珠（GE医疗）。扩增18SrRNA基因的引物18S-F（5’-CACCAGGTTGATTCTGCCTGA）和18S-R（5’-TCTGAAATAGTACGGGCGG）。PCR反应中包含200微米dNTP，0.2微米引物，10mM Tris-HCl（pH9.0）,50毫米氯化钾，1.5毫米氯化镁，2.5U Taq DNA聚合酶和1微升提取的DNA（10纳克至100纳克每微升）。放大进行下列循环参数：到达94°C进行初始化3分钟，然后94°C温度下进行30秒，55°C温度下进行30秒，72°C温度下进行1分钟，做35个此循环周期，并在最后一个周期停留在72°C温度下5分钟。在一个含有溴化乙锭的1.2%琼脂糖凝胶中电泳分析PCR产物。在?1KB一带切除和提取DNA，克隆到pGEM-T-easy载体（Promega）上，命名为克隆pEHP-1。通过DNA测序，克隆的插入为1146bp（GenBankNo.kp759285）。国家生物技术信息中心（NCBI）使用BLAST序列数据库对GenBank的相似序列进行了搜索。

2.4、探针标记和原位杂交

克隆pEHP-1质粒DNA被用来做成原位杂交时的一个探针。Mari等人描述，在PCR反应中，使用了digoxigenin-11-dutp（Roche）标记的基因探针（1998）。用于标记反应的引物EHP-F（5’-GGGAACGACGAACGGCTCAG）和EHP-R1（5’-TGCCTTGATGAGACACTGTT）产生一个1.1 kb的片段。digoxigenin标记的DNA探针，用乙醇沉淀，悬浮在水中，并存储在-20°C。棉虾病，感染了类似于匹里虫的微孢子虫的探针如微孢子虫，是从一个克隆的16SRNA基因区域产生。

戴维森的AFA固定虾进行了处理，石蜡包埋，按照标准方法切片（4微米厚）（莱特纳，1996）。经过脱蜡，水化，蛋白酶K消化，和后固定，切片浸泡在用500微升的杂交液中（4×SSC，50%甲酰胺，1×登哈特的溶液，5%硫酸葡聚糖，0.5微克/毫升鲑鱼精DNA），这种杂交液中含有EHP探针含（0.2μg/ml）。切片放在90°C加热表面上10min，然后在42°C温度下进行一夜的杂交。最终采用硝基蓝四氮唑，5-溴-4-磷酸进行检测抗地高辛抗体共轭碱性磷酸酶（罗氏）。

2.5.EHP的PCR检测。

PCR检测技术，使用了PuReTaqReady-To-Go珠（GE医疗）。探测EHP的引物是EHP-510F(5’-GCCTGAGAGATGGCTCCCACGT)和EHP-510R(5’-GCGTACTATCCCCAGAGCCCGA)。放大进行下列循环参数：到达94°C进行初始化3分钟，然后94°C温度下进行30秒，60°C温度下进行30秒，72°C温度下进行30秒，做35个此循环周期，并在最后一个周期停留在72°C温度下5分钟。

3.结论与讨论

3.1临床症状与EHP感染史

目前，养殖对虾过程中所发生的EHP感染还没有特定的的临床症状。EHP感染通常与发育不良和死亡率上升有关。根据越南境内的鱼塘数据（虾农个人提供的数据）：把感染后的虾苗放入虾塘后的前25天时间内，对虾生长速度正常，之后，对虾的健康状况开始恶化；受感染的对虾饲料进食量减少（50-70%），肝胰脏变色。对虾受到感染之后，其体型（即重量，每周进行一次称重）仅为健康对虾的10-40%。对虾EHP感染死亡率并非一成不变，根据养殖场统计，对虾每天的死亡率约为1?2%。在实验室测定过程中，对虾EHP死亡率并无显著上升，（Tangprasittipap，2013），由于测定持续周期较短（7天），有可能无法检测出死亡率的大幅变化。情况较为严重的EHP感染可能会增加其他细菌感染的易感性。我们发现，在某些情况下，EHP通常伴有弧菌机会性感染（也称为感染性肝胰腺坏死），这可能会导致增加对虾死亡率。

10. 蛋白纯化试剂盒

PCR检测试剂盒基本原理：

通过大量对比某一种细菌或病毒的基因，得到该细菌或病毒共同保守序列，根据该序列设计特异性引物，通过PCR扩增，即可获得相应大小的片段，以此来检测该细菌或者病毒的感染/污染状态。

PCR检测试剂盒结构组成：

①    10mM dNTP；

②    5×Taq 聚合酶buffer(包含引物F和R)；

③    Taq 聚合酶；

④    阳性对照DNA；

⑤    阴性对照DNA；

⑥    加样缓冲液；

⑦    灭菌超纯水。

⑧    常规PCR检测试剂盒说明书。

11. 蛋白质纯化试剂盒怎么用

蛋白提取试剂盒分离亚细胞器后，怎么验证蛋白纯度1.前处理把蛋白质从原来的组织或溶解状态释放出来，保持原来的天然状态，并不丢失生物活性。