1. pcr体系mix的作用
qPCR的体系配制其实与常规的PCR体系是类似的，也包含了buffer、dNTP、DNA聚合酶、引物及模板，不同的地方在于qPCR体系还多了荧光标记（如SYBR Green I或probe）。所有的组分都要提供浓度信息，这对重复qPCR实验至关重要。Buffer中除了缓冲成分，最重要的就是Mg2+，是DNA聚合酶活性的必要条件。
DNA聚合酶除了浓度信息之外还要提供使用的聚合酶名称，如常规的Taq酶或者经过基因改造后具有更多其他特性的聚合酶，使用不同的酶做出的实验结果也不尽相同。引物的使用终浓度一般在100-600nM，探针的使用终浓度一般在200-400 nM。浓度太高易出现非特异扩增，太低则导致过低的扩增效率；因此最佳浓度要根据自己的实验来定，推荐前期预实验可以做一下浓度梯度的探索。
目前，大部分的qPCR实验都会选择使用各种kit，一般会提供2 x qPCR mix，里面预混了DNA聚合酶、SYBR Green I（染料法）、buffer、Mg2+和dNTP等，用户只需要加引物和模板即可。Kit说明书中一般不会提供各个组分的浓度信息，这种情况下，要备注kit的名称及生产厂家，同时，如果不是参照说明书中的配制方法，则要对改动的地方加以说明。
qPCR反应体系中有可能会用到各种添加剂，如DMSO、甜菜碱和BSA等，无非是要提高扩增效率或者反应特异性，如果用到添加剂也要备注工作浓度。值得注意的是有些添加剂对聚合酶是有毒性的，要在其正面和负面作用之间取得平衡，浓度梯度实验是有效的方法之一。
qPCR的反应体系一般在20-50 μl，常规采用20μl。尽量不要使用10 μl体系，加样不易控制且容易挥发，造成variation变大。
耗材及仪器
qPCR板材往往是实验者容易忽略的点。当采用96孔板时，要注意qPCR仪器的兼容类型：全裙边、半裙边及无裙边等。更推荐使用白色管而非透明管，这是因为白色对荧光的反射更彻底，反映在结果上是Cq值更小，从而一定程度上提高了检测的灵敏度，但要注意这对扩增效率是没有影响的[1]。唯一的弊端就是，看不到加样位置，也无法辨别是否有气泡，所以使用白色管时检测前要高速离心。
封膜也是要注意的细节，尽量采用热封，而不要使用粘性膜。手工封膜有可能密封不严，导致技术学重复之间的variation比较大。
qPCR仪器种类繁多，国产的，进口的，深孔的，常规的，等等。要备注使用的仪器型号及生产厂家，这是因为不同的设备做出来的结果很有可能是不同的。特别要注意的是，不同设备做出来的Cq值是没有可比性的，不能通过单纯比较Cq的大小来评判设备的灵敏度等性能指标，而要综合标准曲线等其他因素来衡量。
2. pcr中mix作用
PCR又称聚合酶链式反应，PCR的过程可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。
PCR的三个步骤分别是1.高温变性:利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，；2.低温退火:低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合；3.中温延伸:当调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。它需要DNA模板，上下游引物，taqDNA聚合酶，dNTP以及缓冲液(镁离子很重要)，当然还有超纯水。
当然现在实验室做PCR，买的缓冲液里面是直接加好聚合酶和dNTP的，可以直接用。
一般的25微升体系里DNA模板和上下游引物各1微升，PCR MIX12.5微升，ddH2O9.5微升。
3. pcr反应中mix里面有什么
做PCR时Master Mix是指反应混合物，即PCR试验时使用的预混物。
Master Mix 的配制：一般PCR 的 MasterMix 都是两倍的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。
MasterMix 的配置过程中，需要注意：
1、MasterMix 不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在 4 度。
2、更多的配制 MasterMix 进行，减少加样误差。最好能在冰上操作。
4. pcr扩增中mix里有哪些成分
1. 试剂准备阶段
试剂准备是 PCR 操作的第一个流程，需要在试剂贮存和准备区的超净工作台或生物安全柜进行，用确保无污染的移液器、枪头及容器等进行分装。所有的 PCR 体系都应该在 - 20℃ 保存，除了 ddH 2 O 之外，其余的试剂组份需完全融化之后再加入，以免影响浓度。配制反应体系应在快速进行，以减少非特异性扩增。体系配制完成之后应马上进行 PCR 反应。
2. 样本制备阶段
样本制备是整个 PCR 反应中最为关键的环节，在接收样本时一定要确保样本的密封性以及样本编号的唯一性。严格遵守操作规程进行加样操作，操作时候尽量少说话或者不说话。
所有操作需要在生物安全柜内进行，操作前后生物安全柜需要进行紫外灯消毒，注意生物安全柜中物品的排放。戴手套并勤于更换，要有「无核酸观念」 。
3. 核酸扩增
在核酸扩增环节需要选择质量好的 Ep 管，装入反应体系的 EP 管上机前混匀、离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。在样本检测的同时设立对照（阳性对照、阴性对照、阴性模板、试剂对照）。同时严密检测 PCR 扩增仪的各项性能指标，其中对 PCR 扩增仪而言温度控制就意味着质量。
4. 产物分析
常见问题：
1）无 CT 值出现：模板量不足（杂质的引入及反复冻融的情况等）
2）CT 值出现过晚（大于 38）：各种反应成分的降解或加样量的不足
3）标准曲线线性相关性不佳：加样误差、标准品出现降解等
4）阴性对照有信号：模板有基因组的污染
5）扩增效率低：反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解、反应抑制
6）扩增曲线的异常：模板的浓度太高或荧光染料的降解
四、实验室操作环境的维护
1） 各工作区要有一定的隔离，进入工作区域应按照单一的方向进行。试剂贮存和准备区 → 标本制备区 → PCR 扩增区 → 产物分析区单一方向进行。
2） 各个区域实验用品专用：各个区域实验设备和物品应有明确的标记，不能混用。
3） 实验场所要保持通风良好，严格监测各个工作区的温湿度。
4）注意实验室污染的预防。
整个 PCR 实验的操作都需要特别注意避免污染，来自样本的、试剂的以及实验室各种气溶胶，要始终保持「无核酸观念」。
5. pcr体系的mix是什么
由于进行PCR试验时，往往要向PCR管中加入buffer、dNTP、DNA酶、引物、模板、水等各种PCR反应所需的试剂，而在加入这些试剂时如果操作不规范很容易造成污染，导致PCR结果不准确。
因此，为了简化反复添加各种试剂，便将buffer、dNTP、DNAPolymerase等试剂先混合到一起，即配制成Master Mix然后再使用，即简化了PCR操作步骤，也减少了污染的途经。
6. pcr-mix是啥
20uM引物浓度指得是引物working solution的浓度。
也就是说，当你从装有引物的管内，吸取一定量，加入到PCR master mix配成反应混合液的时候，这个引物管内的浓度是20uM。如果1ul的这个浓度引物加入到50ul反应中，引物终浓度将是0.4uM。实际反应体系中的引物最终浓度最常见是0.5uM，也可在0.1-0.5uM之间选取。20ul体系换算成50ul体系，最简单就是每种要加的试剂或水体积分别乘2.5， 浓度不变即可。
7. mix酶pcr程序
BIOGHC Elitefast SYBR Master Mix包含dNTP Mix、Mg2+、SYBR Green I、BIOG热启动聚合酶，一般来说反应体系中引物终浓度为0.2μM可得到较好的扩增效果，当反应结果不理想时，可以在0.1-1.0μM范围内调整引物浓度。
qPCR反应灵敏性高，模板量的准确性对结果影响很大，建议将模板适度稀释后加入，或用50ul反应体系。
模板体积最好不超过反应体积的10%，操作过程中避免强光照射，扩增产物长度请选择在100bp-500bp范围内，反应条件：95℃加热6-10分钟，以激活热启动DNA聚合酶，然后95℃ 5-15秒，60℃ 30-35秒，进行40个循环。
反应条件可根据目标片段的大小、引物的Tm值等适当调整。
8. pcr扩增mix
PCR检测试剂就是PCR的反应体系，经典PCR以DNA为模板，其体系组成以下几方面:1.原始模板:微生物检验中将待测样本中的细菌或病毒DNA，作为扩增反应的原始模板；
2.引物:两段单链寡核苷酸，其序列与代扩增片段的两端分别相同和互补，作为DNA合成反应的引物；
3.原料:4种脱氧核苷酸三磷酸作为DNA合成的原料；
4.DNA聚合酶:催化DNA合成；
5.合适的盐、缓冲液以及温度循环参数。
9. pcr中的mix成分是什么?作用是什么
1.在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix （2mM）
4 μl 引物1（10pM）
2 μl 引物2（10pM）
2 μl Taq酶 （2U/μl）
1 μl DNA模板（50ng-1μg/μl）
1 μl 加ddH2O至 50 μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，最后在72℃ 保温7min。
3.结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4.PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μl氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测