1. 逆转录所需试剂
载体表达siRNA的基本步骤
(1) 合成模板
合成编码siRNA的DNA模板的两条单链，模板链后面接有RNA PolyII聚合酶转录中止位点，同时两端分别设计BamH I和Hind II 酶切位点，可以克隆到pSilencer2. 1-U6载体多克隆位点的BamH I和Hind II 酶切位点之间。
(2)合成编码siRNA的DNA双链退火按照下列配制反应体系。
编码siRNA的DNA链12μgddH2O45μL编码siRNA的DNA链22μg总体积50μL5mol/L NaCl1μL
95℃，5min,缓慢退火，使DNA单链退火得到siRNA的DNA双链模板。
酶切表达siRNA载体
载体2μgHind Ⅲ1μL10 Xbuffer3μLddH2O23μLBamH Ⅰ1μL总体积30μL
37℃，2-3h,利用试剂盒胶回收。
连接
T4DNA连接酶5U10 X 连接酶Buffer1μL线性化载体2μL加水补足10μL退火后编码 siRNA的DNA2μL
选择载体和编码siRNA DNA的最佳比例，利用T4连接酶16℃连接4h或过夜。
(5)转化
①将100μL感受态细胞于冰上解冻。②取5μL连接产物加人到感受态细胞中，轻轻旋转几次以混匀内容物，在冰上放置30min。③将管放人预加温到42℃的水浴中，热激90s。快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2min。④每管中加700μL LB培养基，37℃ 振荡培养1h，进行复苏。⑤室温3000r/min离心5min,弃去上清后，用剩余100μL培养基重悬细胞并涂布到含抗性的LB琼脂平板表面。注意:细胞用量应根据连接效率和感受态细胞的效率进行调整。⑥将平板置于室温直至液体被吸收。⑦倒置平皿，于37℃培养，12-16h后可出现菌落。
(6)PCR鉴定和测序鉴定
在插人编码shRNA的DNA双链模板两侧设计鉴定PCR引物，扩增片段在100-200bp之间，并可利用载体上的引物进行测序鉴定。
(7)转染细胞
载体可用常用的转染方法进行细胞转染。按照上述体外合成siRNA的方法进行转染。
(8)检测RNA干扰效率
可以在蛋白水平或mRNA水平检测RNA干扰效率。一般情况下，蛋白质的表达变化与mRNA水平的表达变化一.致，也有少数情况下mRNA表达水平变化不及蛋白质表达下降明显。为检测蛋白质的表达情况，可以使用Western Blot。为检测mRNA表达情况，可以使用逆转录和实时定量PCR。
(9) 筛选稳定表达siRNA的克隆
在转染细胞1-3d后，利用载体携带的筛选标记如G418或puromycin进行筛选，杀死不含有siRNA表达载体的细胞，存活下来的是表达siRNA的细胞。
2. 逆转录所需原料
需要rna，逆转录酶，逆转录酶buffer（含有所需的碱基），polyA，polyT，和depc水
3. 逆转录实验过程
1ug等于1000ul啊，直接换算就可以了
4. 逆转录所需要的反应物
RNA复制酶在宿主细胞中合成,逆转录酶是病毒中合成的。
反转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用，目前它已成为一种重要的工具酶。用组织细胞提取mRNA并以它为模板，在反转录酶的作用下，合成出互补的DNA(cDNA)，由此可构建出cDNA文库，从中筛选特异的目的基因，这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因的方法。
病毒RNA进入宿主细胞后，可进行复制，即在RNA指导的RNA聚合酶催化进行RNA合成反应。
5. 转录和逆转录所需要的反应物是什么
反转录和逆转录的区别
“反转录”是指，在生物学中以RNA为模板，通过反转录酶，合成DNA的过程。是DNA生物合成的一种特殊方式。反转录是进行基因工程过程中，以RNA为模板提取出DNA遗传信息的过程。反转录过程由反转录酶催化，该酶也称依赖RNA的DNA聚合酶（RDDP），即以RNA为模板催化DNA链的合成。合成的DNA链称为与RNA互补DNA（cDNA）。
“逆转录”是指，在生物学中以RNA为模板合成DNA的过程，即RNA指导下的DNA合成。此过程中，核酸合成与转录（DNA到RNA）过程与遗传信息的流动方向（RNA到DNA）相反，故称为逆转录。逆转录过程是RNA病毒的复制形式之一，在逆转录的过程中需要逆转录酶的催化。
反转录与逆转录的区别在于，逆转录是RNA类病毒自主行为，在整合到宿主细胞内以RNA为模板形成DNA的过程。二者共同点虽然都是为RNA→DNA的过程，但是发生的地点不同，以两者相对性的来说，反转录是在体外，逆转录是在体内。
6. 逆转录抑制剂
抗艾滋治疗需要终生的药物治疗。一般来说，病人需要同时服用三种抗病毒药物。抗病毒药物只有在体内药物浓度保持一定水平时才起作用。目前，阻断逆转录酶的药物主要有齐多夫定、替诺福韦和奈韦拉平三种，它们都是核苷逆转录酶抑制剂，具有良好的作用。
7. 逆转录试剂盒的作用
逆转录是不需要上下游引物的，可以选择随机引物，也可以用oligo引物，这些都是反转录试剂盒里带的。
8. 逆转录反应条件
逆转录酶（reversetranscriptase） 又称RNA指导的DNA聚合酶。是以RNA为模板合成DNA的酶。这种酶是1970年美国科学家特明（H.M.Temin）和巴尔的摩（D.Baltimore）分别于动物致癌RNA病毒中发现的，他们并因此获得1975年度诺贝尔生理学或医学奖。
当RNA致癌病毒，如鸟类劳氏肉瘤病毒（Rous sar-coma virus）进入宿主细胞后，其逆转录酶先催化合成与病毒RNA互补的DNA单链，继而复制出双螺旋DNA，并经另一种病毒酶的作用整合到宿主的染色体DNA中，此整合的DNA可能潜伏（不表达）数代，待遇适合的条件时被激活，利用宿主的酶系统转录成相应的RNA，其中一部分作为病毒的遗传物质，另一部分则作为mRNA翻译成病毒特有的蛋白质。
最后，RNA和蛋白质被组装成新的病毒粒子。在一定的条件下，整合的DNA也可使细胞转化成癌细胞。 含有逆转录酶的病毒叫做反转录病毒，逆转录酶催化的反应叫反转录（reve-rsetranscrip-tion）。
在这个过程中，遗传信息流动的方向是从RNA到DNA，正好与转录过程相反，故称反转录。病毒逆转录酶含Zn2+，以脱氧核苷三磷酸为底物，从5’到3’合成DNA，反应需要引物。这个酶在许多方面与DNA聚合酶相似。
目前已发现不少动物反转录病毒，近年来也发现了几种人类反转录病毒。
艾滋病毒也是一种反转录病毒。
有的逆转录酶已提纯，可作为合成某些特定RNA的互补DNA的工具酶，也可用于DNA的序列分析和克隆重组DNA。
9. 逆转录浓度
rna复制酶化学本质是蛋白质，rna复制酶它是宿主在核糖体当中合成的。
这说明在这个只有在酶催化下才能完成的核酸大分子的剪切处理过程中,RNA充当了酶的催化作用.这在科学界引’起了很大的震动. 无独有偶,1 983年又有两个实验室的合作研究表明RNA具有催化功能.当时已知催化tRNA前体分子趋向成熟的核糖核酸酶P(RNaseP)是由蛋白质和RNA两部分组成的,然而从RNaseP中分离出的蛋白质组分,在各种条件下均无独立的催化活性；相反,其中的RNA部分,在一定的镁离子浓度条件下,再加上亚精胺,可以具有与天然或重组RNaseP同样的催化活性.并且该RNA可被看作是酶.这一现象的发现者给具有催化活性的RNA定名为ribozyme,即酶性核酸.
10. 反转录需要的试剂
cdna第一链能直接用做PCR或荧光定量PCR的模板，以及第二链cDNA合成或线性RNA扩增的模板，也可用于放射性或非放射性核苷酸标记第一链cDNA的实验 本试剂盒是以mRNA或者总RNA为模板，高效合成第一链cDNA。本产品含有反转录反应所需的全部试剂（BalbScript Reverse Transcriptase，RNase Inhibitor，Oligo(dT)18，Random N6，dNTPs），浓度为2×。反应时只需要加入RNA模板和水即可，操作简单，降低操作过程中的污染。