1. pcr仪和荧光定量pcr仪
它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。
2. 荧光pcr和荧光定量pcr
普通RT-PCR是半定量的。。即需要从条带的亮度判断量的相对多少。。
荧光定量PCR是定量的。。
因为两者反应体系,要求有很大区别,引物通常不能通用。除了上面提到的荧光定量PCR产物要控制在60-200nt之间,退火温度也比较高。。一般要达到60度
3. 荧光定量pcr仪可以做普通pcr吗
基本原理:
荧光PCR技术,是指在普通PCR技术的基础上,在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
主要有两种方法及过程:
1、SYBR Green 染料法
SYBR能够结合到双链DNA上面,当系统中的模板被扩增时,SYBR能够有用结合到新组成的双链上面,跟着PCR的进行,结合的SYBR燃料越来越多,被仪器检测到的荧光信号越来越强,然后到达定量的意图。在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
2、TaqMan探针法:
PCR扩增时在参加一对引物的一起参加一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两头分别标记一个陈述荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,陈述基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;刚开始时, 探针结合在DNA恣意一条单链上;PCR扩增时,Taq酶的5’端-3’端外切酶活性将探针酶切降解,使陈述荧光基团和淬灭荧光基团别离,然后荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,完成了荧光信号的累积与PCR产品形成彻底同步。
4. 普通pcr仪和荧光定量pcr仪区别
半定量RT-PCR与定量RT-PCR的区别是半定量RT-PCR操作简便,可快速推测样品中特异mRNA的相对数量;而定量RT-PCB可实时定量,较半定RT-PCB更准确。
1. 半定量反转录-聚合酶链反应(semi-quantitative reverse transcription and polymerase Chain reaction ,SqRT-PCR)是近年来常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法,通过mRNA反转录成cDNA,再进行PCR扩增,并测定PCR产物的数量,可以推测样品中特异mRNA的相对数量。
2. 定量RT-PCR(quantitative reverse transcription and polymerase Chain reaction ,qRT-PCR)是在用一步法或两步法,在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
半定量RT-PCR与定量RT-PCR的区别是半定量RT-PCR操作简便,可快速推测样品中特异mRNA的相对数量;而定量RT-PCB可实时定量,较半定RT-PCB更准确。
半定量反转录-聚合酶链反应(semi-quantitative reverse transcription and polymerase Chain reaction ,SqRT-PCR)是近年来常用的一种简捷、特异的定量RNA测定方法,通过mRNA反转录成cDNA,再进行PCR扩增,并测定PCR产物的数量,可以推测样品中特异mRNA的相对数量。
定量RT-PCR(quantitative reverse transcription and polymerase Chain reaction ,qRT-PCR)是在用一步法或两步法,在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
半定量RT-PCR需要跑电泳,根据条带亮度的强弱来判断模板拷贝数的高低或者是表达量的高低,而定量RT-PCR则无需电泳可以实时监测整个PCR的全程并且由给出的Ct值及Standard Curve来判断gene拷贝数的高低。
荧光定量PCR和半定量RT-PCR都可以用来检测基因的表达量的,但二者检测的东西多少有些不同.BIOG染料法荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入可以和双链DNA特异性结合的荧光染料或者和目的DNA片段结合的BIOG taqman,通过监控PCR过程中的荧光的变化,并且和某些管家基因的荧光变化进行对比反应出目标基因的表达量.荧光定量PCR的主要有效数据是荧光信号增长到最大值的一半时的时间.半定量RT-PCR则是通过RT-PCR最终产物电泳后电泳条带的明暗来间接反应出原始模板的丰度.荧光定量PCR因为是全程监控PCR扩增的变化,并且能够同管家基因的扩增曲线进行相对定量,而将基因的表达量数值化,准确度高于半定量RT-PCR.半定量RT-PCR因为是监控的最终产物,而在基因表达水平很高的时候,PCR体系很可能在反应中后期就饱和了,所以对于高水平表达的基因来说,用半定量RT-PCR并不能很准确的说明问题.
半定量rt-pcr参照的做法一般有两种:
1) 将要比较的两个样品的beta-actin 调成一样的亮度,然后就可以直接比较目的基因的亮度了。方法的结果比较直观,但较费事。
2) 不进行调平,一个样品里将目的基因和beta-actin直接比较,用软件就可以做到,然后将不同样品的这个比值进行比较就可以了。方法比较简单,但结果不够直观。
1.每个标本都要做自己的内参,不能用同一个内参!
2.每个标本在实际做前都要摸最佳循环数,包括内参,但内参的循环数不一定要和目的基因一样,都要选择上升期的中间数作为最佳循环数,否则进入平台期就没有可比性了!所以内参要有它自己的最佳循环数!
3.电泳扫描后,计算灰度值,先用同一标本的内参和目的进行比较,然后用这个相对值再去和其他你所要比较的平行组进行比较,一般每组4个样本以上。
5. pcr扩增仪和荧光定量pcr
原理不同:荧光定量pcr实时监测与dna结合的荧光染料激发的荧光;逆转录pcr通过检测插入dna中核算染料的量来测定pcr最终产物量,一般是紫外光.
反应要求:荧光定量对扩增片段有较高的要求,一般为100-300bp;普通定量可以扩增长点的片段.如果不需要检测产物分子量大小,荧光定量可以不进行电泳就对产物进行定量分析,逆转录pcr必须电泳.
结果:荧光定量可以实现精确定量,普通pcr则不行.荧光定量体现可以看到整个扩增过程,可以看到扩增效率,溶解温度,直接得到的标准曲线等,这些是普通pcr无法实现的.
6. 荧光定量pcr和酶标仪区别
原理不同:荧光定量pcr实时监测与dna结合的荧光染料激发的荧光;普通pcr通过检测插入dna中核算染料的量来测定pcr最终产物量,一般是紫外光。
反应要求:荧光定量对扩增片段有较高的要求,一般为100-300bp;普通定量可以扩增长点的片段。如果不需要检测产物分子量大小,荧光定量可以不进行电泳就对产物进行定量分析,普通pcr必须电泳。
结果:荧光定量可以实现精确定量,普通pcr则不行。荧光定量体现可以看到整个扩增过程,可以看到扩增效率,溶解温度,直接得到的标准曲线等,这些是普通pcr无法实现的。
如果还不清楚建议去丁香园等网站逛逛,希望可以帮到你
7. 荧光定量pcr仪用途
普通的PCR大多数是定性实验,而实时荧光定量PCR则定量和定性都可以做。应用领域也不一样,普通PCR一般应用于基因组克隆、DNA测序、RNA反转录等,而实时荧光定量PCR一般应用于mRNA表达量分析、绝对定量、蛋白表达、SNP分析、阴阳性解析等领域。不是定量PCR比PCR好,而是两者应用与不同的领域,起到了不同的作用。荧光定量PCR较普通PCR不同的一点就是可以实时检测PCR扩增产物,从而可进行绝对定量或者相对定量。
8. 荧光定量pcr仪是什么
1目的 荧光定量PCR仪是复杂精密仪器,其校准工作需由专业工程师进行。除与仪器厂家达成协议定期校准以外,以实验判断仪器校准状态也可为何时进行仪器校准提供信息。 2范围 新购置、使用中、检修后的荧光定量PCR仪。 3校准用试剂 标准化荧光PCR试验试剂及102、103、104、106标准品。 4校准方法 4.1分析室内质控图,及时发现系统误差。经过分析排除了试剂和人员误差后,确定仪器是否出现了检测偏差需要校准。 4.2确定仪器需校准后,进行仪器状态效验试验 4.2.1准备标准化试剂及标准品 4.2.2在仪器处于校准状态下,用标准化试剂对102、103、104、106标准品进行扩增实验,分别计算标准曲线的斜率、截距、相关性的控制限。 4.2.3绘制标准曲线,观察标准曲线的三个参数是否处在控制范围和102标准品是否检出。 4.2.4当仅有102标准品未检出时,检查实验全过程。再次上机检测102标准品。 4.2.5当102标准品未检出、标准曲线的三个参数超出控制范围或仅出现后者时,先排除实验的人员、试剂因素,再重复实验。如结果依然,联系厂家立即进行仪器校准。
9. 荧光定量pcr仪有什么用
荧光定量检查,它主要是用于支原体衣原体感染的一个检查,它主要是通过PCR原理来检测,是否有过多的支原体衣原体出现感染。
我们常常需要用专门的药敏试验来确诊敏感药物,然后再选择敏感药物对症治疗,是常规检查的一部分,所以医保可以按比例报销的
10. 荧光定量pcr仪器是做什么的
荧光定量PCR是分子生物学实验手段,也是检验科常用的方法。PCR就是把东西扩增,主要检测核糖核酸、DNA、RNA,妇科常用的是HPV检测,常用荧光定量PCR的方法,荧光显影便于监测,定量可以算出体内量有多少。
PCR是一个指数增长的过程,但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线,而是S形曲线。
11. 荧光定量pcr仪作用
数字pcr和荧光pcr哪个更准确在定量PCR时,我们常常纠结一个问题,究竟是相对定量还是绝对定量呢?如今,你无需纠结了,因为数字PCR(digitalPCR)来了。尽管这两种技术有些类似,都是估计起始样品中的核酸量,但它们有一个重要的区别。
定量PCR是依靠标准曲线或参照基因来测定核酸量,而数字PCR则让你能够直接数出DNA分子的个数,是对起始样品的绝对定量。
因此特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域:拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究(如等位基因不平衡表达)、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。