1. 共聚焦作用
一般共聚焦显微镜专用物镜的焦距都很短,只有10倍物镜的焦距可以直接透过96孔板的底部看到细胞。如果你想用更高倍数的物镜观察,必须使用特殊的96孔板,或者特殊的长工作距离物镜。我见别人用过一种底部是0.17mm厚度玻璃的96孔板,这个可以向几个细胞培养耗材生产商问问,长工作距离的物镜可以向共聚焦显微镜的生产商问,一般这个就比较贵了。
2. 什么是共聚焦
GFP是绿色荧光蛋白,在扫描共聚焦显微镜的激光照射下会发出绿色荧光,从而可以精确地定位蛋白质的位置。绿色萤光蛋白(GFP)是一个由约238个氨基酸组成的蛋白质,从蓝光到紫外线都能使其激发,发出绿色荧光。通过基因工程技术,绿色萤光蛋白(GFP)基因能转进不同物种的基因组,在后代中持续表达,并且能根据启动子特异性地表达。
使用GFP必须构建融合蛋白载体,并在转染之后有效表达。这样,若在荧光显微镜下看到细胞内某一部位存在GFP信号,说明和GFP融合的蛋白也存在于该部位,这样就达到了确定某物质亚细胞定位的目的。
3. 共聚焦操作
共聚焦有好几个电源开关,显微镜镜体的开关控制显微镜,对激光器没影响,显微镜寿命很长,对显微镜本身影响也不大。
激光器有自己的开关,如果忘记关,激光器可能会一直发光,激光器的使用寿命一般是几千到几万小时,忘记关只是会无谓的消耗寿命。
汞灯光源也有一个独立开关,汞灯灯泡的寿命一般是400或者2000小时。
4. 共聚焦实验作用
共聚焦显微技术是近十几年迅速发展起来的一项高新研究技术,目前应用领域扩展到细胞学、微生物学、发育生物学、遗传学、神经生物学、生理和病理学等学科的研究工作中,成为现代生物学微观研究的重要工具。
共聚焦显微技术按照显微镜构造原理的不同分成激光扫描共聚焦和数字共聚焦显微技术两种。共聚焦技术具有成像清晰、获得三维图像、进行多标记观察、活细胞内动态生理反应的实时观察记录、定性定量分析等优势,可以应用于亚细胞水平中观察离子水平的变化并结合电生理等技术观察细胞生理活动与细胞形态及运动变化的相互关系等。
5. 共聚焦使用方法
这种聚焦的特点就是对焦速度非常快,所见即所得
6. 共聚焦分析
一、原理不同
1、荧光显微镜:是以紫外线为光源, 用以照射被检物体, 使之发出荧光, 然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。
2、激光共聚焦显微镜:在荧光显微镜成象的基础上加装激光扫描装置,使用紫外光或可见光激发荧光探针。
二、特点不同
1、荧光显微镜:用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。 细胞中有些物质,如叶绿素等,受紫外线照射后可发荧光;另有一些物质本身虽不能发荧光,但如果用荧光染料或荧光抗体染色后,经紫外线照射亦可发荧光。
2、激光共聚焦显微镜:利用计算机进行图象处理,从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象,以及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。
7. 共聚焦系统
共聚焦显微镜能查螨虫,螨虫在放大100倍的显微镜下就能看清。
8. 共聚焦的原理
是荧光样品,就应该都可使用以上仪器检测(只用TIRF受一些限制)。但是实际应用时,大家可能会碰到某些样品可以使用流式和显微镜,但是无法使用共聚焦。为什么?解释一下:
首先,荧光检测必须有激发光照明,染料被特定波长的光照射以后才能发射荧光。激发光源有两种:1)白光(汞灯、氙灯等),然后通过滤光片选择只通过特定波长的光。如检测GFP时,大家能看到蓝光照射在样品上,因为GFP的激发条件是488nm 光。但是有一点,显微镜不可能装无限多的滤光片,所以选择是有限的。2)激光,普通的激光器只能发射特定波长的光,且数量有限,常见的是405、488、514、543、633等,所以可使用的染料也是有限。因此,大家判定仪器能否满足你实验要求,务必先看看激发条件是否合适。
其次,在光检测器(PMT、CCD)前还有一块滤光片,作用是反射样品各种散射光,只通过特定波长的荧光,提高信噪比,得到干净的背景。因此,这块滤光片也决定了仪器能否满足你的实验要求(不用太担心,这个一般和激发滤光片配套,不会有太多问题)。而在光谱型共聚焦里,使用的是棱镜或衍射光栅分光,可以选择通过任意需要的波段。这对使用量子点做标记的同学特别有好处!